廣東地區(qū)漢族人群TLR1基因多態(tài)性的測序研究*

張 斌， 肖 林， 肖文娟， 劉澤寰△

(1暨南大學(xué)生命與健康工程研究院，廣東廣州510632;2中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院，廣東珠海519000)

Toll樣受體1(toll－like receptor 1，TLR1)基因編碼TLR1蛋白，因其與果蠅的Toll蛋白和人類的白細(xì)胞介素1(interleukin－1，IL－1)受體的同源性而得到確認(rèn)。該基因位于人基因組4p14，長度為8 537 bp，有4個外顯子區(qū)(exon)，分別位于 －5 960～－5 923、－5 551～－5 475、－2 117～－2 026和－67～2 576(以翻譯起始密碼ATG的A為+1)。外顯子1、2、3連同外顯子4的前67 bp是5'非翻譯區(qū)(untranslated region，UTR)，外顯子4尾部的216 bp是3'UTR。

TLR1蛋白是一種1型跨膜蛋白，由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)組成。該蛋白含有786個氨基酸，前22個氨基酸為信號肽(signal peptide，SP)，23～582的氨基酸序列組成其胞外區(qū)，583～605是跨膜區(qū)，606～786為其胞內(nèi)區(qū)。其中胞內(nèi)區(qū)包含有 TIR (Toll/interleukin－1 receptor)結(jié)構(gòu)域，而胞外區(qū)則具有富含亮氨酸的重復(fù)序列(leucine－rich repeat，LRR)［1］。LRR序列一般由24個氨基酸組成，其特征是亮氨酸間隔分布于幾個固定位點，此結(jié)構(gòu)有利于促進(jìn)蛋白質(zhì)間的相互黏附，故可用來識別病原體或其產(chǎn)物;胞內(nèi)區(qū)胞內(nèi)段由Toll同源結(jié)構(gòu)域(Toll homology domain，THD)和分子羧基端長短不同的短尾肽組成，與人IL－1受體的胞內(nèi)區(qū)具有同源性。在TLR蛋白家族中，TLR1和LTR6存在高度的同源性，分別能與TLR2形成異二聚體，主要功能是與TLR2結(jié)合識別革蘭氏陽性菌及革蘭氏陽性菌其細(xì)胞壁成分如脂肽、脂蛋白等。然而TLR1/2和TLR1/6在對微生物的識別上，均有各自的專一性，例如二?；暮腿；模?］。

近年來涉及到TLR1基因多態(tài)性導(dǎo)致免疫系統(tǒng)應(yīng)答和疾病易感性的證據(jù)不斷出現(xiàn)。例如位于TLR1基因編碼的胞外區(qū)域11號LRR區(qū)域的非同義突變單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)位點+944 C/T(Pro315Leu，rs5743613)就與胞外受體的配體識別有關(guān)。盡管沒有與這個SNP位點直接關(guān)聯(lián)的疾病被報道，但可以肯定的是它對識別細(xì)菌細(xì)胞壁成分的天然免疫防衛(wèi)產(chǎn)生著負(fù)面的易感性影響［3］。而位于TLR1基因編碼的跨膜區(qū)域的非同義突變SNP位點+1 805 G/T(Ser602Ile，rs5743618)也被認(rèn)定是一個與 TLR1功能相關(guān)的SNP位點。這個位點的突變改變了細(xì)菌脂肽識別，并潛在地影響到天然免疫應(yīng)答機(jī)制和一些相關(guān)疾病的易感性［4］。

TLR1在天然免疫應(yīng)答機(jī)制上對于識別外源病原體具有重要作用，但國內(nèi)對TLR1基因遺傳多態(tài)性研究幾乎處于空白狀態(tài)，所以對中國漢族人TLR1基因單核苷酸多態(tài)性的研究，探究分子水平上的個體及群體差異性是十分必要的。針對這種情況，本研究采用高分辨率的PCR直接測序的方式，隨機(jī)篩查50例廣東地區(qū)漢族人TLR1基因的調(diào)控區(qū)、5'和3'非翻譯區(qū)以及4個外顯子區(qū)的功能性多態(tài)性位點，初步建立起廣東漢族人TLR1基因的功能性多態(tài)圖譜。這些工作，將會為進(jìn)一步研究該基因多態(tài)性與中國人常見其它自身免疫疾病的相關(guān)性研究打下良好基礎(chǔ)。

材料和方法

1 樣本收集和基因組DNA提取

從采集到的廣東地區(qū)漢族無親緣關(guān)系、健康個體的抗凝外周血樣本中隨機(jī)抽取50例作為研究樣本，采血對象年齡在19～48歲間，男女性別比例為1∶1.2。用E.Z.N.A.?血液DNA抽提試劑盒(Omega)提取基因組DNA。本研究獲得暨南大學(xué)附屬第二醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，所有采血對象均簽署知情同意書。

2 目的片段的擴(kuò)增和測序

根據(jù)GenBank公布的人類TLR1基因信息(Accession:NC_000004;Reglon:38797876～38806412; Versoon:NC_000004.11;GI:224589816)，用Oligo 6.0軟件(Molecular Biology Insight Inc.)設(shè)計引物，對隨機(jī)抽取的50例廣東漢族人TLR1基因的啟動子區(qū)、5'和3'非翻譯區(qū)、4個外顯子區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增引物見表1。PCR擴(kuò)增條件為:94℃變性5 min;之后35個循環(huán):95℃變性30 s，退火30 s(各片段退火溫度見表1)，72℃延伸90 s;最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用3S Spin PCR產(chǎn)物純化試劑盒(上海申能博彩公司)純化后，用ABI PRISM 377自動測序儀測序(英韋創(chuàng)津公司)，測序引物與擴(kuò)增引物相同，每個擴(kuò)增片段均進(jìn)行正、反向2次測序。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

參照GenBank參考序列，用 ClustalX 1.81軟件［5］比對測序結(jié)果獲得TLR1基因多態(tài)性位點信息及其頻率分布;用SPSS 13.0軟件進(jìn)行卡方檢驗以驗證Hardy－Weinberg平衡;用DnaSP 5.10軟件［6］計算Tajima's D、Fu＆Li's D值和頻譜分析;用軟件Haploview 4.1［7］進(jìn)行連鎖不平衡分析。

表1 PCR擴(kuò)增及測序引物Table 1 .Primers for PCR amplication and sequencing

結(jié)果

通過對50例廣東漢族人TLR1基因啟動子區(qū)、5'和3'非翻譯區(qū)以及4個外顯子區(qū)等功能性區(qū)域進(jìn)行分段擴(kuò)增，分別得到了與5種預(yù)期目的片段長度一致的擴(kuò)增結(jié)果，見圖1。在此基礎(chǔ)上針對這些擴(kuò)增片段構(gòu)成的總長為5 813 bp的區(qū)域進(jìn)行測序，共發(fā)現(xiàn)17個SNPs位點和2個插入/缺失(insertions and deletions)多態(tài)，見表2，分別為:－6 876 C/T、－6 847 A/G、－6 737 A/T、－6 399 C/T、－6 375 C/T、－6 010 C/T、－5 531 A/G、－5 507 A/G、－5 490 C/ G、－2076C/T、+130C/T、+743A/G、+936C/T、 +1 378 A/G、+1 482 A/G、+1 518 A/G、+1 937 C/T、－6 912 C/TA和－5 984－/CT。所有多態(tài)性位點均符合Hardy－Weinberg平衡(P＞0.05)。其中，前8個位于啟動子調(diào)控區(qū)，中間4個位于5'非翻譯區(qū)，后7個位于編碼區(qū)。對比美國國立生物信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)db-SNP數(shù)據(jù)庫的已有數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，其中SNPs位點+936 C/T和+1 378 A/G屬于首次發(fā)現(xiàn)，見圖2，且位于編碼區(qū)的新SNP位點+1 378 A/G為非同義突變位點，能導(dǎo)致460位絲氨酸(Ser)殘基替換為甘氨酸(Gly)殘基，并且這個氨基酸殘基的替換處于TLR1胞外區(qū)的LRR結(jié)構(gòu)域中，從而有可能影響蛋白的識別功能。

表2 廣東漢族人群TLR1基因功能性多態(tài)性位點的相關(guān)信息Table 2 .Characterization of functional genetic polymorphisms in TLR1 locus in Cantonese Han population

Figure 1.Electrophoresis analysis of amplified DNA fragments from TLR1 gene.A:including promoter，exon 1，intron 1 and exon 2 region(－7 038～－5 286);B:exon 3(－2 339～－1 959);C:partial exon 4(－281～1 100);D:partial exon 4 (731～2 386);E:partial exon 4(2 148～2 789)M:DNA marker.1:PCR products.圖1 TLR1基因擴(kuò)增片段電泳圖

Figure 2.Two novel SNPs found in TLR1 gene.A:promoter(+936，C/T genotype);B:promoter(+1378，A/G genotype).The arrows represent mutation sites.圖2 TLR1基因中新發(fā)現(xiàn)的2個SNPs位點

將廣東漢族人群TLR1基因的多態(tài)性位點頻率數(shù)據(jù)與歐洲人群、日本人群和非洲人群進(jìn)行了比較，見表3。廣東漢族人和歐洲人在絕大多數(shù)多態(tài)性位點的頻率分布上差異顯著;與日本人相比，在rs55830619、rs45588337、 rs5743556、 rs5743557、rs56357984、rs5743565、rs5743566、rs5743596 及rs4833095等的頻率分布上也有較大的差異;而非洲人群則由于數(shù)據(jù)不全，因此可比性不強(qiáng)，但在僅有的多態(tài) 性 位 點 rs1873196、rs5743553、rs5743557、rs5743565、rs5743596及rs4833095的頻率分布上差別還是非常顯著的，2個在廣東漢族人中低頻的位點在非洲人群中卻頻率較高，而3個在廣東漢族人中呈現(xiàn)高頻的位點在非洲人群中卻完全觀察不到。至于位點rs146929931、rs145843781及rs143576719則在其他人群中的頻率至今尚未見報道。

表3 廣東漢族人群TLR1基因功能性多態(tài)性位點的等位基因頻率與其他人群的比較Table 3 .Functional genetic polymorphisms and their minor allele frequencies of TLR1 in different populations

在以上測序結(jié)果和SNPs頻率分布數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，本研究還分析了TLR1基因全部功能區(qū)的核苷酸多樣性水平(nucleotide diversity，π)，為1.5×10－3，高于人類基因組的平均水平(0.8×10－3)［8］。中性檢驗結(jié)果顯示，TLR1基因功能區(qū)的Tajima's D值和Fu＆Li's D值分別為1.38062和1.73756，前者不顯著(P＞0.1)，后者有較強(qiáng)的顯著性(P＜0.02)，說明該基因一定程度地背離了中性進(jìn)化，很可能受到平衡選擇的作用。頻譜分析也發(fā)現(xiàn)，TLR1基因多態(tài)性位點的頻譜分布不符合中性進(jìn)化，見圖3，中高頻突變過多，很可能是平衡選擇造成的。

Figure 3.The frequency spectrum analysis of the functional regions of TLR1 gene.The curve represents expected values.Histogram represents the actual observed values.圖3 TLR1基因功能區(qū)的頻譜分析

用Haploview 4.1對TLR1基因19個多態(tài)性位點進(jìn)行連鎖不平衡分析發(fā)現(xiàn)，多態(tài)性位點－6 912 C/ TA、－6 876 C/T、－6 399 C/T、－6 375 C/T之間(Block 1)，－6 847 A/G和－6 737 A/T之間，以及－5 984－/CT、－5 531 A/G和－5 490 C/G之間(Block 2)完全連鎖(r2=1);位點－6 010 C/T和Block 2之間，+743 A/G和+1 518 A/G之間，以及Block 1和Block 2之間緊密連鎖(r2＞0.8)，見圖4。

討論

本研究新發(fā)現(xiàn)的SNP位點+1 378 A/G為非同義突變位點，能導(dǎo)致460位Ser殘基替換為Gly殘基，并且這個氨基酸殘基的替換位于TLR1胞外區(qū)的LRR結(jié)構(gòu)域中。有報道指出，LRR序列被認(rèn)為與病原體模式分子的識別有關(guān)［9］，而處于LRR序列中的非同義SNP就很有可能影響到蛋白對于病原體的識別。比如處于TLR1基因LRR序列上的非同義SNP位點Pro315Leu(rs5743613)就與TLR1蛋白識別病原體的免疫防衛(wèi)機(jī)制有關(guān)［10］。

人類先天免疫相關(guān)基因的多態(tài)性水平通常較低［11］。但在本研究中卻發(fā)現(xiàn)，廣東漢族人群TLR1基因功能區(qū)的核苷酸多樣性明顯高于人類基因組平均水平。這說明，廣東漢族人群TLR1基因在進(jìn)化過程中可能受到不尋常因素的影響。通過Tajima's、Fu＆Li's檢驗以及頻譜分析我們發(fā)現(xiàn)，TLR1基因多態(tài)性明顯背離中性進(jìn)化理論。為此，我們進(jìn)一步將TLR1功能區(qū)序列分為調(diào)控序列和外顯子序列兩部分來進(jìn)行中性檢驗，發(fā)現(xiàn)外顯子區(qū)沒有背離中性進(jìn)化，而是調(diào)控區(qū)可能受到了平衡選擇的作用，Tajima's D值為2.09685(P＜0.05)。這說明TLR1基因的調(diào)控區(qū)可能具有重要的生物學(xué)功能。當(dāng)然，這種結(jié)果還有可能由搭便車效應(yīng)、群體瓶頸效應(yīng)或者群體結(jié)構(gòu)改變造成。

Figure 4.Linkage disequilibrium(LD)plot of the functional polymorphisms in TLR1 gene.The r2(×100)values were depicted in the diamonds.White:r2=0;grey:0＜r2＜1;black:r2=1.圖4 廣東漢族人群TLR1基因功能性多態(tài)性位點的連鎖不平衡分析

人類基因多態(tài)性在不同種群、地區(qū)間的分布具有明顯差異。在本研究中，廣東漢族人與歐洲人、非洲人在TLR1基因多態(tài)性頻率分布上差異明顯。比如，在廣東漢族人樣本中，沒有發(fā)現(xiàn)在歐洲和非洲人群中高頻且與疾病易感的非同義SNPs位點+1 805 G/T(Ile602Ser，rs5743618)，有證據(jù)顯示Ile602Ser這個位于TLR1跨膜區(qū)的SNP位點能調(diào)節(jié)細(xì)菌脂肽的識別，從而影響著天然免疫應(yīng)答和對一些病原體的臨床易感性［12］。還有報道指出，在節(jié)段性回腸炎患者中，602Ser突變的純合子個體是最早表現(xiàn)出回腸末端炎癥反應(yīng)的［13］。同樣，前面提到的與TLR1蛋白識別病原體的免疫防衛(wèi)機(jī)制有關(guān)的Pro315Leu也未在廣東漢族人樣本中檢測到。這些均可能是選擇壓力、遺傳漂變與遷徙等因素導(dǎo)致不同地區(qū)人群的等位基因頻率發(fā)生分化的結(jié)果。

本研究發(fā)現(xiàn)的19個多態(tài)性位點如進(jìn)一步用于TLR1基因的疾病相關(guān)性研究或臨床檢驗，可以根據(jù)連鎖不平衡分析的結(jié)果進(jìn)行精簡，篩選出較有代表性tSNP(tag SNP)后再進(jìn)行檢驗。其中要注意的是，本來應(yīng)從內(nèi)部完全連鎖的Block 1、Block 2、－6 847 A/G和－6 737 A/T之間各選擇一個tSNP位點，但由于 Block 1和 Block 2之間以及 －6 010 C/T (rs56357984)和Block 2之間緊密連鎖，因此可合并選擇一個tSNP，原則上應(yīng)在調(diào)控區(qū)的啟動子和轉(zhuǎn)錄調(diào)控位點附近選擇，因為之前的分析已指出，調(diào)控區(qū)受到平衡選擇，相對于選擇中性的外顯子2可能在功能上更加重要;另外，緊密連鎖的 +743 A/G (rs4833095)和+1 518 A/G(rs5743614)之間也可以選擇一個作為tSNP，應(yīng)首選引起氨基酸改變的非同義突變rs4833095;此外，在不連鎖的其余位點中，處于編碼區(qū)的同義突變 +936 C/T、+1 482 A/G (rs143576719)以及+1 937 C/T(rs72493538)沒有太大的研究價值，建議可以省略。

由于TLR1在天然免疫中具有重要的作用，其基因多態(tài)性與疾病的易感關(guān)系已越來越成為研究熱點。但是，由于人群之間等位基因頻率分布的差異較大，直接選擇其他人種、民族人群中已發(fā)現(xiàn)的高風(fēng)險位點在中華民族人群中進(jìn)行研究是不妥當(dāng)?shù)?。為此，本研究首次系統(tǒng)、全面地建立了廣東漢族人群TLR1基因功能區(qū)的多態(tài)性圖譜，它將為今后在漢族人群中開展TLR1蛋白功能、疾病易感性、致病機(jī)理乃至人群進(jìn)化研究提供重要基礎(chǔ)。

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