高效液相色譜法測定藥物涂層支架中zotarolimus的含量

李沅，姜熙，樊鉑，崔紅天津市醫(yī)療器械質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心，天津，300191

高效液相色譜法測定藥物涂層支架中zotarolimus的含量

【作者】李沅，姜熙，樊鉑，崔紅天津市醫(yī)療器械質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心，天津，300191

目的建立藥物涂層支架中zotarolimus的含量測定方法。方法高效液相色譜法，使用Zorbax Eclipse XDB-C8(4.6×75 mm 3.5 μm)色譜柱；流動相MPA(醋酸鹽緩沖液：乙腈=51:49)、 MPB(醋酸鹽緩沖液：乙腈=5:95)；檢測波長278 nm。結(jié)果在質(zhì)量濃度5 μg/ml～75 μg/ml范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系(r=0.99986)，平均回收率為101.58%，RSD=0.68% (n=6)。結(jié)論本方法簡便、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，可用于藥物涂層支架中zotarolimus的含量測定。

高效液相色譜法；藥物涂層支架；zotarolimus；含量測定

藥物涂層支架是將藥物直接或通過適當(dāng)?shù)妮d體涂布于金屬支架表面，成為一種藥物緩釋系統(tǒng)。廣義的藥物涂層支架分為兩大類：一類是在支架表面包被磷酸膽堿、肝素、碳化物和硅碳合金等，以減少血栓的形成或降低再狹窄率（被動涂層）；另一類則是通過支架表面的特定載體控制釋放某些抗增生的藥物（如雷帕霉素或紫杉醇等）或基因、細胞等，通過與血管壁持續(xù)作用而抑制支架術(shù)后血管內(nèi)膜的過度增生，從而降低再狹窄的發(fā)生率（主動涂層）。后者常被稱為藥物洗脫支架[1]。藥物在局部以“洗脫”方式緩慢釋放，可以滿足靶部位的有效藥物濃度，降低全身毒副反應(yīng)，并在（涂層）對藥物的緩釋作用下獲得足夠的作用時間。Zotarolimus涂層支架是美國美敦力公司的產(chǎn)品。Zotarolimus作為雷帕霉素的一種新型衍生物，具有較強的抗冠脈平滑肌細胞增殖的活性，且能有效抑制免疫機制的作用[2]。研究表明，Zotarolimus洗脫支架在4周后可明顯起到降低內(nèi)膜增生的作用[3]。

由于藥物涂層支架在預(yù)防冠脈再狹窄方面較金屬裸支架具有明顯優(yōu)勢，因此近年來帶藥支架在冠脈介入治療中的應(yīng)用數(shù)量日趨增多。然而，目前國內(nèi)的醫(yī)療器械質(zhì)檢部門對藥物涂層支架中的藥物成分分析和含量測定的研究尚處于起步階段，相關(guān)研究報道較少。這主要是由于不同器械制造商的涂藥工藝，涂層特性和藥物種類千差萬別，給藥物涂層支架中的藥物提取和鑒別測定帶來了一定的困難。針對不同設(shè)計屬性的器械，質(zhì)檢機構(gòu)需要設(shè)計不同的試驗方案，并在此基礎(chǔ)上對分析特定藥物的色譜條件進行研究。本文在大量試驗的基礎(chǔ)上，建立了Zotarolimus涂層支架中藥物含量的高效液相色譜測定方法。該方法操作簡單，重現(xiàn)性好，結(jié)果穩(wěn)定，為保證該類產(chǎn)品的質(zhì)量提供了有價值的質(zhì)控方案。

1 儀器與試藥

1200型高效液相色譜儀(美國安捷倫)，UV紫外檢測器，G1316A型色譜工作站。Zotarolimus對照品(臺灣神隆股份有限公司提供 Batch No：71061AA019)。zotarolimus藥物涂層支架（批號為0001928216，0001928217，0001928218，美國美敦力公司提供)。乙腈為色譜純，醋酸氨為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件

色譜柱Zorbax Eclipse XDB-C8(4.6×75 mm 3.5 um )；流動相MPA（醋酸鹽緩沖液：乙腈=51:49）和 MPB（醋酸鹽緩沖液：乙腈=5:95）；梯度洗脫時間見表1。

表1 梯度洗脫時間表Tab.1 Gradient elution time-table

采集前27 min內(nèi)的數(shù)據(jù)。

2.2測試條件

柱溫45±2oC；檢測波長278 nm；流速1.5 ml/min；進樣量20 μl。

2.3溶液配制

2.3.1 供試品溶液 用移液管精密量取適量MPA移入棕色試樣瓶中，將測試藥物支架置入提取介質(zhì)中(支架必須完全浸入浸提介質(zhì)中)。用聚四氟乙烯內(nèi)襯螺帽蓋住試樣瓶。用超聲波對樣品進行加速溶解，（超聲波水浴溫度控制在20oC～35oC）。提取液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，濾液直接進樣分析。

2.3.2 對照品溶液 精密稱取Zotarolimus對照品20 mg，用乙醇定容至100 ml容量瓶，作為標(biāo)準(zhǔn)儲備液。用移液管將2.5 ml、7.5 ml、12.5 ml、25 ml、37.5 ml儲備液移入100 ml容量瓶，并用MPA進行稀釋，制得5 μg、15 μg、25 μg、50 μg、75 μg /ml對照品溶液。

圖1 高效液相色譜圖Fig.1 HPLC curves

2.4 方法適用性試驗 依給定的色譜條件，分別取空白溶液、對照品溶液和供試品溶液各20 μl，分別進樣，記錄色譜圖。它們的色譜圖分別為圖A、圖B和圖C。zotarolimus主峰的保留時間約為22 min,與其異構(gòu)體組分峰的分離度為2.18，理論板數(shù)為7293[4]。

2.5線性關(guān)系

分別取“2.3.2”項下方法配制的對照品溶液，按給定的色譜條件進行測定，記錄各濃度的色譜峰面積。以峰面積(Y)對溶液濃度(X)求回歸方程為Y=3611108X-2.45596(r=0.99986)，在5 μg/ml～75 μg/ml范圍內(nèi)，峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系。

2.6精密度試驗

取濃度為25 μg/ml的對照品溶液連續(xù)進樣5次，RSD=0.47%，表明所選定的色譜條件系統(tǒng)穩(wěn)定。

2.7重現(xiàn)性試驗

取同一批樣品（批號0001928216）5件，按“2.3.1”項下方法配制供試品溶液，分別進樣，記錄峰面積并計算含量，結(jié)果的RSD=0.43%(n=5)，表明方法重現(xiàn)性好。

2.8回收率試驗

取6份已知含量的樣品，分成3組，每組分別加入對照品溶液（200 μg/ml）0.2ml、0.1ml、0.05 ml，測定峰面積，計算回收率。結(jié)果見表2，測得平均回收率為101.58%，RSD=0.68%(n=6)。

表2 加樣回收試驗結(jié)果（n=6）Tab.2 Results of the labeled recovery rate（n=6）

2.9穩(wěn)定性試驗

精密吸取同一供試品溶液，按給定的色譜條件在 0 h、2 h、4 h、6 h和8 h分別進樣測定峰面積，RSD=0.9%，表明樣品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.10樣品含量測定

取3批樣品，分別按供試品溶液的制備方法，制備待測溶液。取20μl進樣，分別進樣2次，測定峰面積，計算含量，記錄色譜圖見圖1C，結(jié)果見表2。另按給定的色譜條件，取20 μl標(biāo)準(zhǔn)品及空白溶液進樣，分別記錄色譜圖，見圖1B和圖1A。按外標(biāo)法以峰面積計算，3批樣品含量測定結(jié)果，見表3。

表3 樣品含量測定結(jié)果（n=3）Tab.3 Results of the sample drug content（n=3）

3 討論與小結(jié)

3.1 由于溶劑及藥物中的其它雜質(zhì)在100%MPA的流動相條件下洗脫時間較長，為了縮短分析時間，同時避免雜質(zhì)峰對下一個待測樣品的干擾，故采用梯度洗脫的方式。在Zotarolimus及其異構(gòu)體完全洗脫后，改變流動相比例達到快速分離雜質(zhì)的目的。

3.2 將Zotarolimus對照品溶液置紫外-可見分光光度計于240 nm～320 nm波長范圍內(nèi)掃描，確定待測物質(zhì)Zotarolimus的最大吸收波長為278 nm,并以此作為檢測波長。

3.3 在樣品處理過程中，超聲處理可使樣品溶解充分，經(jīng)超聲處理可去除未被濾除的微小不溶物，以確保溶液澄清。超聲波水浴溫度控制在20oC～35oC，防止zotarolimus分解。

3.4 本試驗待測組分有兩個色譜峰，分別是zotarolimus及其異構(gòu)體，應(yīng)按峰面積加和法計算。此方法更能準(zhǔn)確測定zotarolimus總量。

3.5 通過對3批藥物支架含量的測定表明，該方法操作簡單，重現(xiàn)性好，結(jié)果穩(wěn)定。由于藥物支架的含量測定方法國內(nèi)報道不多，故此研究為保證該產(chǎn)品的質(zhì)量提供了有價值的測定方法。

[1] 馬長生. 冠心病介入治療——技術(shù)與策略[M]. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 2001

[2] Chen YW, Smith ML, Sheets M, et al. Zotarolimus, a novel sirolimus analogue with potent anti-proliferative activity on coronary smooth muscle cells and reduced potential for systemic immunosuppression[J]. Cardiovasc Pharmacol, 2007, 49: 228-235.

[3] Garcia-Touchard A,Burke SE, Toner JT, Cromack K, Schwartz RS.Zotarolimus-eluting stents reduce experimental coronary artery neointimal hyperplasia after 4 weeks[J]. Eur Heart, 2006, 27: 988-993.

[4] 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典(一部), 附錄VD. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 2005

國產(chǎn)智能膠囊式內(nèi)窺鏡系統(tǒng)

膠囊式內(nèi)窺鏡系統(tǒng)與傳統(tǒng)消化系統(tǒng)內(nèi)鏡檢查不同，患者在吞服智能膠囊后，智能膠囊在其消化道內(nèi)運動的過程中，可對消化道壁進行實時攝像，并將數(shù)字信號傳輸至患者體外攜帶的圖像記錄儀上。醫(yī)生借助圖像記錄儀和影像工作站系統(tǒng)分析所采集到的圖像，便可對病情做出進一步診斷，而膠囊則隨患者排泄物自行排出。整個過程無創(chuàng)傷、無痛苦、無交叉感染，不影響患者的正常工作，免除了傳統(tǒng)檢測方法所帶來的痛苦和不便，同時又解決了傳統(tǒng)內(nèi)鏡不能較好檢查小腸部位的問題。

膠囊式內(nèi)窺鏡系統(tǒng)是微電子技術(shù)、圖像處理技術(shù)、無線通信技術(shù)等與生物醫(yī)學(xué)相結(jié)合的一項高科技項目，回音必集團杭州華沖科技有限公司承擔(dān)國家“863”計劃微電子領(lǐng)域課題、國家醫(yī)療診斷設(shè)備重點攻關(guān)項目研制工作的數(shù)年間，在國家“863”計劃項目組的指導(dǎo)和協(xié)助下，科研人員堅持不懈地創(chuàng)新，在HT型膠囊式內(nèi)窺鏡系統(tǒng)在低功耗數(shù)?；旌霞呻娐沸酒鉀Q方案、低功耗SOC系統(tǒng)設(shè)計、射頻無線啟動開關(guān)、醫(yī)學(xué)圖像處理以及高清數(shù)字視頻的研發(fā)等方面獲得重大突破，達到世界先進水平。

HT型膠囊內(nèi)鏡系統(tǒng)的體積、分辨率和重量等方面與國內(nèi)同類型產(chǎn)品相比，有明顯改進。尤其是膠囊內(nèi)的核心技術(shù)部分——主控芯片，擁有我國自主知識產(chǎn)權(quán)。該項創(chuàng)新降低了膠囊式內(nèi)窺鏡的功耗和成本。在采用相同電池的情況下，該膠囊式內(nèi)窺鏡的工作時間比同類產(chǎn)品長1.5～2倍，這樣醫(yī)生就有足夠的時間進行完整的小腸檢查，即使對腸胃蠕動能力差的患者也可以輕松完成。

2011年3月1日，HT型膠囊式內(nèi)窺鏡系統(tǒng)獲得國家食品藥品監(jiān)督管理局頒發(fā)的醫(yī)療器械注冊證。3月7日-14日在北京國家會議中心“十一五”國家重大科技成就展醫(yī)藥重大專項展區(qū)展出，受到好評。

全球消化系統(tǒng)疾病發(fā)病率逐年上升，我國每年就有至少8000萬人接受胃腸道疾病檢查。若按1%的患者接受膠囊式內(nèi)窺鏡檢查計算，國內(nèi)就已有近30億元的市場規(guī)模，前景很誘人。

膠囊式內(nèi)窺鏡制造基地已在杭州經(jīng)濟技術(shù)開發(fā)區(qū)建成，一期工程將形成年產(chǎn)智能膠囊10萬粒的產(chǎn)能。

（本刊訊）

Determination of the Content of Zotarolimus on the Drug Eluting Stents by HPLC

【W(wǎng)riters 】Li Yuan, Jiang Xi, Fan Bo, Cui Hong Tianjin Supervision and Testing Center for Medical Devices, 300191

HPLC, drug stent, zotarolimus, content determination

TH781

B

10.3969/j.issn.1671-7104.2011.02.017

1671-7104(2011)02-0134-03

2010-09-25

姜熙，E-mail: jiangxi8305@126.com

【 Abstract 】ObjectTo establish a method for the content determination of zotarolimus on the durg eluting stents.MethodsHPLC analysis was carried out with Zorbax Eclipse C8 colum(4.6×75 mm 3.5 μm)and MPA acetate buffer solution: acetonitrile (51:49), MPB acetate buffer solution: acetonitrile(5:95)as the mobile phase. The detection wavelength was 278 nm.ResultThere was a good linear relationship between the concentration of zotarolimus and the areas in the range of 5 μg/ml～75 μg/ml (r=0.99986). The average recovery was 101.58% with RSD 0.68%(n=6).ConclusionThe method is simple, accurate and reproducible. It can be used as the quality test for zotarolimus on the durg eluting stents.