脂肪基質(zhì)血管成分移植促進(jìn)隨意皮瓣成活的實驗研究

盛玲玲 杜子婧 李華 李慧婕 周達(dá) 李青峰

脂肪基質(zhì)血管成分移植促進(jìn)隨意皮瓣成活的實驗研究

盛玲玲 杜子婧 李華 李慧婕 周達(dá) 李青峰

目的探討脂肪基質(zhì)血管成分（Stromal vascular fraction，SVF）移植是否可以促進(jìn)隨意皮瓣成活，及其作用的相關(guān)機(jī)制。方法分離4周齡Wistar大鼠脂肪中的SVF及骨髓中的單個核細(xì)胞（BM-MNCs），RT-PCR檢測VEGF和bFGF在兩種細(xì)胞中的表達(dá)。根據(jù)移植細(xì)胞的不同，將24只Wistar大鼠分成3組，分別為對照組、BM-MNCs組和SVF組。在大鼠背部設(shè)計一個10 cm×3 cm大小的矩形皮瓣，分別將含有5×107個SVF及BM-MNCs的混懸液各1 mL均勻注射至皮下組織層，對照組單純注射1 mL PBS。2 d后，皮瓣掀開原位縫合，術(shù)后7 d統(tǒng)計皮瓣的成活率。取各組皮瓣相同部位的組織，實時定量PCR檢測組織中VEGF和bFGF基因的表達(dá)。結(jié)果SVF和BM-MNCs細(xì)胞中VEGF和bFGF的表達(dá)無明顯差別（P＞0.05）。皮瓣原位縫合后7 d，SVF組和BM-MNCs組皮瓣的成活率分別為（72.2±2.0）%和（76.4±3.1）%，均明顯高于對照組的（56.8±4.6）%（P＜0.05）。實時定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)SVF組和BM-MNCs組皮瓣組織中VEGF和bFGF基因的表達(dá)明顯升高。結(jié)論SVF移植入皮瓣后可以通過旁分泌生長因子如VEGF和bFGF等增加皮瓣的成活面積。

脂肪基質(zhì)血管成分隨意皮瓣血管化

骨髓單個核細(xì)胞（Bone marrow-derived mononuclear cells,BM-MNCs）已被證實可以通過促進(jìn)隨意皮瓣的毛細(xì)血管新生而提高皮瓣的成活率[1]。BMMNCs是骨髓中的異質(zhì)性細(xì)胞群體，分離后無需培養(yǎng)即可直接應(yīng)用。但是，骨髓抽吸是有創(chuàng)的，給病人帶來極大的痛苦，使得BM-MNCs的臨床應(yīng)用受限。脂肪基質(zhì)血管成分（Stromal vascular fraction，SVF）是膠原酶消化脂肪后獲得的含有脂肪干細(xì)胞的細(xì)胞群體，如同BM-MNCs，SVF分離后也無需培養(yǎng)即可應(yīng)用。脂肪在人體中的存儲量大，脂肪抽吸對組織損傷小，可反復(fù)抽取。因此，獲取大量的SVF是非常容易的。SVF成為細(xì)胞治療的新選擇，極有可能被應(yīng)用于臨床。目前，SVF已成功應(yīng)用于缺血組織的血管化治療，如缺血心肌[2]、缺血下肢[3-4]，取得了滿意的效果，但是尚無SVF應(yīng)用于隨意皮瓣缺血治療的研究。本實驗旨在觀察SVF是否可以促進(jìn)隨意皮瓣成活，并探討其相關(guān)機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

Wistar大鼠（上海斯萊克實驗動物有限公司）；Ⅱ型膠原酶（Sigma公司，美國）；培養(yǎng)基（Gibco公司，美國）；PCR試劑盒（Invitrogen公司，美國）；MX3000P熒光定量PCR儀（Stratagene公司，美國）。1.2細(xì)胞的分離

1.2.1SVF的分離

4周齡Wistar大鼠麻醉處死后，在無菌條件下分離獲得腹股溝脂肪墊。剪碎后，加入適量0.2%Ⅱ型膠原酶，于37℃搖床振蕩1 h。膠原酶消化結(jié)束后，加入相同量的含10%胎牛血清的培養(yǎng)基終止膠原酶的作用。離心收集沉淀后，加入紅細(xì)胞裂解液（Sigma公司，美國），于37℃溫箱中裂解5 min。過濾后離心收集所得沉淀，即為SVF。

1.2.2BM-MNCs的分離

大鼠處理同上。分離出股骨和脛骨后，用注射器吸取其中的骨髓，用Percoll液（Sigma公司，美國）密度梯度離心收集骨髓中的單個核細(xì)胞，即為BMMNCs。

1.3RT-PCR檢測VEGF和bFGF基因在SVF和BM-MNCs細(xì)胞中的表達(dá)

分別收集3×106個SVF和BM-MNCs，Trizol-氯仿抽提，異丙醇沉淀，乙醇洗滌，獲得細(xì)胞RNA的混懸液。測OD值后定量反轉(zhuǎn)錄成cDNA。PCR擴(kuò)增后凝膠電泳顯示目的基因的條帶。所用血管內(nèi)皮生長因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（Basic fibroblast growth factor，bFGF）及內(nèi)參β-actin的基因引物序列見表1。

1.4 細(xì)胞移植及動物實驗

細(xì)胞計數(shù)后，分別將5×107個SVF及BMMNCs重懸于1 mL PBS中備用。

實驗動物禁食8 h后，3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，俯臥位固定，在大鼠背部設(shè)計10 cm×3 cm的隨意型皮瓣，皮瓣蒂部平于髂后上棘連線。根據(jù)移植細(xì)胞的不同，將24只（體重約200 g）的Wistar大鼠隨機(jī)分成3組，每組8只，分別為對照組、BMMNCs組和SVF組。分別將含有SVF及BM-MNCs的混懸液1 mL均勻注射至皮下組織層，對照組單純注射1 mL PBS。2 d后，掀起皮瓣，保留皮瓣下的肉膜層。結(jié)扎創(chuàng)面活躍出血點，皮瓣原位縫合。

1.3 皮瓣成活率測定

皮瓣術(shù)后7 d，肉眼觀察皮瓣成活情況并測定皮瓣成活率。皮瓣壞死的標(biāo)準(zhǔn)為：皮膚顏色變黑、組織回縮、彈性差、切割不出血。拍照后圖像輸入計算機(jī)，應(yīng)用IPP 6.0圖像分析系統(tǒng)，計算出皮瓣成活率。

1.4SYBR GreenⅠ實時定量PCR檢測皮瓣組織中VEGF和bFGF的表達(dá)

無菌條件下取各組皮瓣（n＝3）壞死界線旁開1 cm處的組織，勻漿后提取RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。按照定量PCR試劑盒分別加樣后，PCR反應(yīng)在MX3000P Real Time PCR儀上進(jìn)行，采用β-actin作為內(nèi)參（各引物序列見表1）。根據(jù)反應(yīng)產(chǎn)物的溶解曲線，數(shù)據(jù)經(jīng)MX3000P Corparative Quantitative軟件進(jìn)行自動定量分析。

表1VEGF、bFGF及內(nèi)參β-actin的基因引物Table 1Primers sequences of VEGF,bFGF and β-actin genes

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS 13.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，兩兩之間的比較采用t檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1VEGF和bFGF基因在SVF和BM-MNCs的表達(dá)

RT-PCR檢測脂肪基質(zhì)血管成分及骨髓單個核細(xì)胞的VEGF和bFGF的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在內(nèi)參β-actin表達(dá)相近的情況下，SVF和BM-MNCs兩者之間的VEGF、bFGF的表達(dá)無明顯差別（圖1）。

圖1 術(shù)后7 d各組皮瓣成活情況及成活率統(tǒng)計（箭頭指示壞死界限；＊：P＜0.05）Fig.1Flap survival of the three groups and statistic analysis 7 days after surgery(Arrows show the necrosis boundaries;*:P＜0.05)

2.2 皮瓣成活率統(tǒng)計

皮瓣壞死區(qū)域與成活區(qū)域的界線明顯，SVF組的皮瓣成活率為（72.2±2.0）%，BM-MNCs組的皮瓣成活率為（76.4±3.1）%，均高于對照組（56.8±4.6）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；SVF組和BM-MNCs組之間無明顯差別（P＞0.05）（圖2）。

圖2 各組皮瓣組織vWF免疫組化染色（箭頭所指為毛細(xì)血管；＊：P＜0.05；100×）Fig.2Anti-vWF staining of the flap tissues (Arrows show capillaries;*:P＜0.05;100×)

2.3VEGF和bFGF基因在各組皮瓣組織中的表達(dá)

收集各組皮瓣組織后，實時定量PCR檢測獲取各組基因的Ct值，采用2-△△Ct的方法，將對照組的基因表達(dá)校正為1倍量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)VEGF和bFGF在SVF移植組和BM-MNCs移植組皮瓣組織中的表達(dá)明顯上調(diào)，與對照組的差異顯著（圖3）。

圖3 各組皮瓣組織VEGF和bFGF表達(dá)情況（＊：P＜0.05）。Fig.3Gene expression levels of VEGF and bFGF in flap tissues of different groups(*:P＜0.05)

3 討論

皮瓣轉(zhuǎn)移修復(fù)是整形外科的常用技術(shù)，常用來修復(fù)因創(chuàng)傷、腫瘤切除等引起的組織缺損。皮瓣自身的低氧環(huán)境雖然可以促進(jìn)其血管化，但是不足以平衡缺血、缺氧帶來的組織損傷，導(dǎo)致皮瓣遠(yuǎn)端發(fā)生缺血性壞死。如果能在術(shù)前實現(xiàn)皮瓣的血管化，則有望大大降低壞死面積。

血管化主要包括血管新生和血管形成[5-6]。血管新生是在原來存在的血管結(jié)構(gòu)上長出新血管的生物學(xué)過程。血管形成是指內(nèi)皮祖細(xì)胞遷移至某部位，分化發(fā)育為新血管。血管化過程主要是受多種生長因子的調(diào)節(jié)。單獨應(yīng)用VEGF、bFGF已被證明可以促進(jìn)隨意皮瓣血管化，提高成活率[7－8]。但是生長因子的應(yīng)用受限于其單一性及在體內(nèi)較短的半衰期。干細(xì)胞移植治療可望解決了這一問題，植入體內(nèi)的干細(xì)胞可持續(xù)分泌多種促血管化生長因子，從而發(fā)揮比單純生長因子更持久、更有效的作用。

骨髓單個核細(xì)胞促進(jìn)皮瓣成活的作用可能與移植入體內(nèi)的細(xì)胞持續(xù)分泌生長因子，如VEGF和bFGF有關(guān)[1]。本實驗檢測了這兩種基因在SVF和BM-MNCs的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)VEGF和bFGF在這兩種細(xì)胞群中的表達(dá)差異不大。由于VEGF和bFGF是目前公認(rèn)的與促血管化作用關(guān)系最密切的兩種生長因子[9]，此結(jié)果在一定程度上表明在皮瓣的缺血治療中，SVF有可能發(fā)揮同BM-MNCs一樣的效果。其中，bFGF主要是在血管再生的早期起作用，bFGF能誘導(dǎo)內(nèi)皮祖細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的活化，可能起啟動血管再生的作用[10]。而VEGF則是在血管化后期調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和分化[10]，VEGF還可以抑制低氧環(huán)境中內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡[11]，趨化周圍組織和骨髓中的干細(xì)胞至缺血部位[12]。

本實驗中，SVF和BM-MNCs移植入皮瓣后都能明顯提高皮瓣的成活率，兩組之間的效果無明顯差別，但與對照組之間都存在顯著性差異，與Sumi等[3]的實驗結(jié)果相符。Sumi等將小鼠的SVF和BMMNCs移植入缺血下肢中，使得缺血下肢的血流強(qiáng)度、血管的數(shù)量顯著增強(qiáng)，下肢組織成活率明顯高于對照組，SVF組和BM-MNCs組之間無差別。

目前關(guān)于細(xì)胞移植的治療性血管化作用的機(jī)理集中于植入細(xì)胞的直接分化和持續(xù)分泌多種生長因子。但是，細(xì)胞移植入體內(nèi)后成活率極低[12-13]，其分化的細(xì)胞不足以促進(jìn)血管化的發(fā)生。因此，其持續(xù)的旁分泌能力被認(rèn)為是發(fā)揮促血管化作用的主要機(jī)理。在本實驗中，VEGF、bFGF在植入SVF和BMMNCs的皮瓣組織中表達(dá)明顯上調(diào)，這可能是SVF和BM-MNCs直接分泌VEGF、bFGF的結(jié)果，也是促進(jìn)皮瓣成活的主要原因。

有學(xué)者認(rèn)為，BM-MNCs和SVF作為異質(zhì)性細(xì)胞群體，在血管化過程中，細(xì)胞群體中的各種細(xì)胞可以發(fā)揮協(xié)調(diào)作用，從而發(fā)揮著比同質(zhì)性干細(xì)胞群更大的作用[14]。另外，SVF和BM-MNCs的應(yīng)用還可以減少獲取同質(zhì)性干細(xì)胞所需的體外培養(yǎng)時間（一般為2～3周），避免了長時間體外培養(yǎng)引發(fā)的干細(xì)胞分化和突變[15]。

通過本實驗研究發(fā)現(xiàn)SVF移植可以通過旁分泌VEGF、bFGF等發(fā)揮促進(jìn)皮瓣血管化的作用，從而減少皮瓣的壞死面積，效果與BM-MNCs移植無明顯差異。隨著對SVF認(rèn)識的逐步加深，SVF將有望被廣泛應(yīng)用于皮瓣缺血的治療。

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Effect of Stromal Vascular Fraction Transplantation on Improvement of Random Skin Flap Survival

ObjectiveTo investigate effect of SVF transplantation on survival of random skin flap and explore the relative mechanism.MethodsSVF and bone marrow-derived mononuclear cells(BM-MNCs)were isolated from 4-week-old Wistar rats.The gene expressions of VEGF and bFGF in SVF and BM-MNCs were detected by RT-PCR.Twenty-four Wistar rats were selected to make 10 cm×3 cm skin flap at back,and were randomly divided into 3 groups according to different suspension fluid which were injected subcutaneously to treat flaps(n＝8):control group,BM-MNCs group and SVF group. Two days later,the flap was raised and sutured.Seven days after the operation,the survival of skin flap in 3 groups was observed.A piece of flap at same place was taken and quantitative expression of VEGF and bFGF was detected by quantitative PCR.ResultsThe expressions of VEGF and bFGF were same in SVF and BM-MNCs.The survival ratio of skin flap in BM-MNCs group(76.4±3.1)%and SVF group(72.2±2.0)%were both obviously higher than the control group(56.8±4.6)%, P＜0.05.The expression of VEGF and bFGF in BM-MNCs and SVF groups was distinctly higher than the control group. ConclusionSVF can improve the viability of skin flap by the para-secreting of VEGF and bFGF.

Stromal vascular fraction;Random skin flap;Neovascularization

R622

A

1673－0364（2011）03－0143－04

SHENG Lingling,DU Zijing,LI Hua,LI Huijie,ZHOU Da,LI Qingfeng.
Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People′s Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China.Corresponding author:LI Qingfeng(E-mail:liqfliqf@yahoo.com.cn).

2011年3月29日，

2011年4月18日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2011.03.006

國家自然科學(xué)基金項目（30730092，30925034）、國家杰出青年科學(xué)基金（30925034）、上海市曙光計劃基金（09CG14）。

200011上海市上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院整復(fù)外科。

李青峰（E-mail：liqfliqf@yahoo.com.cn）。