譚小力， 魏明玉， 袁偉偉

從萌發(fā)的油菜種子中制備脂肪酶

譚小力， 魏明玉， 袁偉偉

(江蘇大學生命科學研究院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

測定不同萌發(fā)期油菜幼苗的脂肪酶活性，采用“鹽析→超濾→M-Bondapak-C18柱層析”的工藝路線，建立一種簡單且高效的油菜脂肪酶純化方法。結(jié)果表明：通過測定不同培養(yǎng)時間的油菜幼苗的脂肪酶比活力，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)6d的油菜幼苗脂肪酶比活力最高，此時期的油菜幼苗適合作為脂肪酶提取的材料；對脂肪酶比活力為1.89U/mg的油菜蛋白粗提物采用鹽析法沉淀脂肪酶時，得到脂肪酶的比活力為2.07U/mg，回收率為82.47%；采用截留分子質(zhì)量為10000D的超濾膜對脂肪酶鹽析物進行脫鹽和除去小分子雜蛋白處理，得到的脂肪酶的比活力為2.46U/mg，回收率為75.84%；進一步采用M-Bondapak-C18柱層析純化超濾液，脂肪酶最高比活力為9.14U/mg，回收率為34.13%。所得到的脂肪酶的活性達到了商品化脂肪酶的水平。

油菜籽種子；脂肪酶；純化；鹽析；超濾；柱層析

脂肪酶(triacylglycerol acylhydrolase，EC 3.1.1.3，甘油三酰酯水解酶)是分解三脂酰甘油的水解酶類，在油水界面上，脂肪酶催化三?；视偷孽ユI水解，釋放含有更少酯鍵的甘油酯或甘油及脂肪酸[1]。脂肪酶在生物柴油的制備[2]、油脂水解和精煉[3]、食品風味和香味的改進[4]、醫(yī)藥[5]、皮革絹紡脫脂[6]、洗滌劑[7]和化妝品[8]等行業(yè)中都具有廣泛的用途。

脂肪酶廣泛存在于動植物和微生物中[9-10]。早在1834年就有了對兔胰脂肪酶活性的報道，到20世紀初國外研究人員首次發(fā)現(xiàn)了微生物脂肪酶。微生物脂肪酶資源豐富，作用pH值及溫度范圍廣，在研究應用方面進展很快[9]。早在1967年，中國科學院微生物研究所篩選到一株解枝假絲酵母(Candida lipolytica)AS2.1203，并于1969年制成酶制劑投放市場[11]。動植物體內(nèi)雖存在脂肪酶，但是由于原材料生長周期長、提取也較困難等因素，所以發(fā)展比微生物脂肪酶慢的多[9]。植物中含脂肪酶較多的是油料作物的種子，如油菜籽[12]。當油菜種子萌發(fā)時，脂肪酶能與其他的酶協(xié)同發(fā)揮作用催化分解種子中的油脂，生成糖類以提供種子生根發(fā)芽所必需的物質(zhì)和能量[13]。

近十多年來，由于化石能源的儲量越來越少，同時產(chǎn)生大量的二氧化碳，生物能源作為可持續(xù)發(fā)展的再生能源受到日益重視，油脂由于單位分子所存儲的能量多，是生物能源的很好的形式，一般直接酯化，生成生物柴油[14]。目前大量采用的是化學法生產(chǎn)生物柴油，但化學法生產(chǎn)過程需高溫高壓，生產(chǎn)過程耗費大量能源，同時產(chǎn)生廢酸廢堿，污染環(huán)境，由于生產(chǎn)生物柴油用的是脂肪酶催化法，生產(chǎn)條件溫和，生產(chǎn)過程沒有污染，被認為是最有前途的方法[15]，但由于脂肪酶生產(chǎn)成本高、催化效率低等問題，制約著脂肪酶催化法應用于生物柴油的生產(chǎn)[16]。目前生產(chǎn)生物柴油所用的原料大部分來自植物油，因此，從油料作物油菜中分離到的脂肪酶制備生物柴油應具有專一性強、催化效率高的特點。

迄今為止，國內(nèi)還未見對油菜脂肪酶提取純化的方法。參考從微生物中提取純化脂肪酶的方法[17-18]，本實驗首先測定不同培養(yǎng)時間的油菜幼苗中脂肪酶的比活力，然后從比活力最高時期的油菜幼苗中提取脂肪酶，采用鹽析→超濾→M-Bondapak-C18柱層析的方法，得到純度較高的脂肪酶。通過本實驗所制備的脂肪酶，研究來源于油料作物種子萌發(fā)期的脂肪酶催化生成生物柴油的專一性和高效性，為下一步在油菜種子萌發(fā)期克隆脂肪酶基因，然后轉(zhuǎn)化到工程菌中，大規(guī)模生產(chǎn)油菜脂肪酶打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

寧油12號油菜種子由江蘇省農(nóng)業(yè)科學院提供。在培養(yǎng)箱里培養(yǎng)寧油12號油菜種子，種子吸漲完全時第一次取樣，以后每隔1d取一次樣，共10次，樣品保存于-70℃冰箱。

曲拉通X-100 美國Amresco公司；對硝基苯基月桂酸酯 美國Sigma-Aldrich公司；牛血清蛋白(BSA) 北京拜爾迪公司；異丙醇、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉為分析純；氨水為化學純。

1.2 儀器與設(shè)備

冷凍離心機 日本Hitachi公司；6305 型紫外-可見光分光光度計 英國Jenway公司；601 型超級恒溫水浴鍋、HJ-3 控溫磁力攪拌機、XH-C 漩渦混合器 江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠；層析柱(2.0cm×50cm) 、BT-100E恒流泵、HD-21-88 紫外檢測儀 上海琪特分析儀器有限公司；超濾管 美國Millipore公司；DBS-100 電腦自動部分收集器 上海滬西分析儀器廠；N2000 雙通道色譜工作站 浙江大學智達信息工程有限公司。

1.3 方法

1.3.1 粗酶液的制備

取-70℃冰箱保存的樣品，在液氮中充分研磨至面粉狀，得到的粉末以3:10(m/V)的比例與蛋白提取液(0.025mol/L，pH7.0的Tris-磷酸鈉緩沖液)混合，每毫升混合液中加入0.2mol/L二硫蘇糖醇(DTT)10μL，0.2mol/L EDTA 2μL，1mmol/L蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟(PMSF) 1μL，振蕩均勻后于4℃、12000r/min離心20min，上清液即為粗酶液。

1.3.2 脂肪酶比活力的測定

反應體系中含有50mmol/L的Tris-磷酸鈉緩沖液，100μmol/L的對硝基苯酚月桂酸酯底物溶液和酶溶液(0～2.5mg/mL)。底物溶于10mL異丙醇中，緩緩加入100mL 50mmol/L，pH7.0的曲拉通 X-100磷酸鈉緩沖液配成反應液。每900μL反應液加入100μL粗酶液，37℃保溫15min后，于4℃、12000r/min離心30s終止反應。在實驗條件下，每分鐘生成1μmoL對硝基苯酚為一個酶活力單位，對硝基苯酚濃度的測定采用分光光度法[19]。酶比活力用1mg蛋白質(zhì)中脂肪酶的活力單位數(shù)表示。將脂肪酶的純化倍數(shù)定義為處理液中脂肪酶的比活力與粗提液中脂肪酶的比活力的比值。

1.3.3 總蛋白質(zhì)含量的測定

采用考馬斯亮藍比色法進行測定，以BSA為標準蛋白[20]。

1.3.4 脂肪酶回收率的測定

將脂肪酶的回收率定義為處理液中脂肪酶的酶活力與粗提液中脂肪酶的酶活力的比值。脂肪酶的回收率按下式計算。

式中：C1為粗提液中脂肪酶的酶活力/(U/mL)；V1為粗提液的總體積/mL；C2為脂肪酶純化得到的處理液中脂肪酶的酶活力/(U/mL)；V2為脂肪酶純化得到的處理液的總體積/mL。

1.3.5 脂肪酶的純化

1.3.5.1 鹽析

將提取的粗酶液邊攪拌邊向其中加入固體硫酸銨，使其中的硫酸銨質(zhì)量濃度分別達到100、200、300、400、500、600、700、800g/L，搖勻后靜置30min，然后于4℃、4000r/min離心10min，棄去上清液，將蛋白質(zhì)沉淀用蒸餾水溶解得到鹽析液。

1.3.5.2 超濾

用超濾的方法對脂肪酶鹽析物進一步進行脫鹽、除雜蛋白和濃縮處理，采用截留分子質(zhì)量為10000D的超濾管。取上一步得到的鹽析液放入超濾管中，于4℃、4000r/min離心8min，離心后在超濾管內(nèi)補滿蒸餾水再離心，重復3次。用BaCl2溶液檢測透過液中無白色沉淀時即為超濾終點。然后把超濾管倒置在離心機中，于4℃、4000r/min離心20min，再向管中加1mL的蒸餾水振蕩溶解超濾產(chǎn)物。

1.3.5.3 M-Bondapak-C18離子交換層析

M-Bondapak-C18按產(chǎn)品說明書要求進行處理。裝柱(2.0cm×50cm柱)后，用蒸餾水平衡。將上一步得到的超濾液用蒸餾水稀釋3倍后于12000r/min離心10min上柱，先后用氨水和含lmol/L NaCl的0.05mol/L磷酸鈉緩沖液洗脫(緩沖液pH8)，流速為5mL/min，洗脫液體積為400mL；收集活性峰，透析，冷凍干燥備用。

2 結(jié)果與分析

2.1 油菜種子萌發(fā)期脂肪酶比活力的變化

為了確定萌發(fā)期提取脂肪酶的最佳時間，本實驗研究了油菜脂肪酶在萌發(fā)期的動態(tài)變化。如圖1 所示，寧油12號油菜種子萌發(fā)的前3d，脂肪酶比活力很小，隨著油菜芽的不斷生長，其脂肪酶比活力不斷增大；當萌發(fā)6d時，脂肪酶比活力達到最高；萌發(fā)6d后，脂肪酶比活力不斷降低。由此可見，油菜萌發(fā)后脂肪酶比活力最高的時期是培養(yǎng)6d的油菜苗。此時期的油菜苗可用來作為脂肪酶提取純化的材料。

圖1 油菜種子萌發(fā)期脂肪酶比活力的變化Fig.1 Dynamic change of lipase activity in rapeseed during germination

2.2 鹽析過程中硫酸銨質(zhì)量濃度對脂肪酶回收率和純化倍數(shù)的影響

圖2 硫酸銨質(zhì)量濃度對脂肪酶回收率的影響Fig.2 Effect of concentration of ammonium sulphate on the recovery rate of lipases

圖3 硫酸銨質(zhì)量濃度對脂肪酶純化倍數(shù)的影響Fig.3 Effect of concentration of ammonium sulphate on the purity of lipases

如圖2、3 所示，硫酸銨質(zhì)量濃度為400g/L時，脂肪酶的回收率達到了很高。當硫酸銨質(zhì)量濃度超過600g/L時，由于溶液密度較大，脂肪酶沉淀物懸浮于上清液的表面，不容易被分離。當硫酸銨質(zhì)量濃度為100g/L時，只出現(xiàn)少量的蛋白沉淀。當硫酸銨質(zhì)量濃度為200g/L時，有比較明顯的蛋白質(zhì)沉淀，此時脂肪酶的純化倍數(shù)最大。當硫酸銨質(zhì)量濃度繼續(xù)增加，純化倍數(shù)降低很多。綜合考慮，先用質(zhì)量濃度為100g/L的硫酸銨鹽析，除去雜蛋白，然后采用質(zhì)量濃度為400g/L的硫酸銨進行鹽析。采用這種方法對脂肪酶進行初步純化，脂肪酶的比活力為2.07U/mg，回收率為82.47%，純化倍數(shù)達到1.12倍。

2.3 超濾對脂肪酶回收率和純化倍數(shù)的影響

超濾能除去脂肪酶提取液中的一些雜蛋白，提高脂肪酶溶液的純度。采用截留分子質(zhì)量為10000D的超濾膜純化脂肪酶，實驗結(jié)果顯示，脂肪酶的比活力為2.46U/mg，回收率為75.84%，純化倍數(shù)為1.19倍。

2.4 M-Bondapak-C18離子交換層析不同洗脫液對脂肪酶回收率和純化倍數(shù)的影響

圖4 M-Bondapak-C18離子交換層析洗脫曲線Fig.4 Elution curve of M-Bondapak-C18ion exchange chromatography

為了進一步純化所提取的脂肪酶，利用離子交換層析法進行分離純化。由圖4可見，分離得到2個活性峰，分別為氨水和含lmo/L NaCl的0.05mol/L磷酸鈉緩沖液(pH8)洗脫得到的洗脫峰。最后得到的脂肪酶分離純化的結(jié)果如表1所示。發(fā)現(xiàn)層析峰2的純化效果遠遠高于層析峰1。層析峰2的脂肪酶最后回收率達到了34.13%，純化倍數(shù)約為5倍。

表1 M-Bondapak-C18離子交換層析對回收率和純化倍數(shù)的影響Table 1 Effect of M-Bondapak-C18ion exchange chromatography on the recovery rate and purity of lipases

3 結(jié) 論

油菜籽萌發(fā)后第6天是脂肪酶活性最高的時期，此時的油菜芽是脂肪酶提取并分離純化的最佳時期。通過鹽析法沉淀、超濾膜濃縮、離子交換柱層析等手段對油菜芽中的脂肪酶純化，最終得到的脂肪酶比活力為9.14U/mg，總回收率為43.94%。

[1]REIS P, HOLMBERG K, WATZKE H, et al. Lipases at interfaces: a review[J]. Advances in Colloid and Interface Science, 2009, 147/148: 237-250.

[2]MEHER L C, SAGAR D V, NAIK S N. Technical aspects of biodiesel production by transesterification: a review[J]. Renewable and Sustainable Energy Reviews, 2006, 10(3): 248-268.

[3]吳秋明, 葉興乾, 吳丹, 等. 脂肪酶在食品工業(yè)中的應用[J]. 糧油加工與食品機械, 2004(11): 72-73.

[4]縱偉, 董海麗. 脂肪酶及其在食品工業(yè)中的應用[J]. 安徽農(nóng)學通報, 2007, 13(15): 14-15.

[5]AL-BAHRANI A Z, AMMORI B J. Clinical laboratory assessment of acute pancreatitis[J]. Clinica Chimica Acta, 2005, 362(1/2): 26-48.

[6]陳雄金. 脂肪酶的研究及其應用[J]. 科技信息, 2008(19): 58; 34.

[7]鄭毅, 吳松剛, 施巧琴. 洗滌劑用酶: 堿性脂肪酶的研究概述[J]. 日用化學工業(yè), 2001, 31(1): 35-38.

[8]SARNEY D B, FREGAPANE G, VULFSON E N. Lipase-catalyzed synthesis of lysophospholipids in a continuous bioreactor[J]. Journal of the American Oil Chemistociety, 2007, 71(1): 93-96.

[9]高貴, 韓四平, 王智, 等. 國內(nèi)脂肪酶研究狀況分析[J]. 生物技術(shù)通訊, 2003, 14(6): 543-545.

[10]SHARMA R, CHISTI Y, BANERJEE U C. Production, purification, characterization and applications of lipases[J]. Biotechnology Advances, 2001, 19(8): 627-662.

[11]孫宏丹, 孟秀香, 賈莉, 等. 微生物脂肪酶及其相關(guān)研究進展[J]. 大連醫(yī)科大學學報, 2001, 23(4): 292-295.

[12]谷利偉, 趙金蘭. 酶技術(shù)在油脂工業(yè)中的應用[J]. 中國油脂, 1998, 23(5): 43-45.

[13]EASTMOND P J. SUGAR-DEPENDENT1 encodes a patatin domain triacylglycerol lipase that initiates storage oil breakdown in germinating Arabidopsis seeds[J]. The Plant Cell, 2006, 18: 665-675.

[14]DEMIRBAS A. Progress and recent trends in biofuels[J]. Progress in Energy and Combustion Science, 2007, 33(1): 1-18.

[15]RANGANATHAN S V, NARASIMHAN S L, MUTHUKUMAR K. An overview of enzymatic production of biodiesel[J]. Bioresource Technology, 2008, 99(10): 3975-3981.

[16]GUPTA R, GUPTA N, RATHI P. Bacterial lipases: an overview of production, purification and biochemical properties[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2004, 64(6): 763-781.

[17]舒正玉, 楊江科, 閆云君. 黑曲霉F044 脂肪酶的分離純化及酶學性質(zhì)研究[J]. 生物工程學報, 2007, 23(1): 96-100.

[18]胡泊, 吳勝, 楊柳, 等. 嗜冷枯草芽孢桿菌低溫脂肪酶純化與酶學性質(zhì)研究[J]. 微生物通報, 2007, 34(3): 524-527.

[19]RUIZ C, FALCOCCHIO S, XOXI E, et al. Activation and inhibition of Candida rugosa and Bacillus-related lipases by saturated fatty acids, evaluated by a new colorimetric microassay[J]. Biochimica et Biophysica Acta, 2004, 1672(3,11): 184-191.

[20]許淑芳, 朱江, 劉鄰渭, 等. 考馬斯亮蘭G-250法測定蘋果濃縮汁生產(chǎn)中的蛋白含量[J]. 飲料工業(yè), 2005, 8(1): 45-48.

Preparation of Lipase from Germinated Rapeseed

TAN Xiao-li，WEI Ming-yu，YUAN Wei-wei
(Institute of Life Sciences, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China)

The lipases in the germinating seeds of oil crop have high specificity and efficiency to the substrate plant oil, the main sources in biodiesel production. The lipase activity during the different stages of rapeseed germination was determined, and accordingly, lipase was purified by salting out, ultrafiltration, and M-Bondapak-C18column chromatography sequentially. The results showed that: 1) During the different stages of germinating seeds, the lipase activity in 6-day-old seedling was at the peak. Therefore, 6-day-old seedlings were chosen as the material for lipase extraction; 2) After salting-out, the specific activity of lipase was improved from 1.89 U/mg to 2.07 U/mg, with a recovery rate of 82.47%; 3) After ultra filtration with 10000 D membrane, the specific activity of lipase was improved to 2.46 U/mg, and the recovery rate was 75.84%; 4) The specific activity of further purified lipase by C18column chromatography was improved to 9.14 U/mg, with the recovery rate being 34.13%. The activity of final lipase prepared reached the level of commercial lipase.

rapeseed；lipase；purification；salting out；ultrafiltration；column chromatography

Q814.1

A

1002-6630(2011)03-0148-04

2010-04-12

國家“973”計劃項目(2006CB101600)

譚小力(1968—)，男，副研究員，博士，研究方向為植物油脂代謝。E-mail：xltan@ujs.edu.cn