李 潔，余澤英，趙宗美，顏怡君，馬志剛，劉 奇

（大理學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000）

洱海下游腸道致病菌噬菌體分離與鑒定

李 潔，余澤英，趙宗美，顏怡君，馬志剛，劉 奇*

（大理學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000）

目的：分離洱海下游水體中的腸道致病菌噬菌體，了解腸道致病菌污染情況。方法：通過噬菌斑法從洱海下游水體中分離和鑒定各種腸道致病菌噬菌體。結(jié)果：成功分離出了痢疾桿菌噬菌體、傷寒桿菌噬菌體、乙型副傷寒桿菌噬菌體、大腸桿菌噬菌體4種腸道致病菌噬菌體。結(jié)論：洱海下游水體存在痢疾桿菌、傷寒桿菌、乙型副傷寒桿菌、大腸桿菌污染，提示需進(jìn)一步加強(qiáng)大理周邊生活污水排放的治理工作。

腸道致病菌;洱海；噬菌體

洱海是中國(guó)7大淡水湖之一，也是云南省第2大淡水湖〔1〕。20世紀(jì)70年代以來，洱海一直遭受著各種人為的污染，并呈現(xiàn)逐年惡化的趨勢(shì)〔2〕。盡管近年來國(guó)家和當(dāng)?shù)卣度肓舜罅康娜肆Α⑽锪?duì)洱海進(jìn)行綜合治理，并取得了顯著成效，但目前對(duì)洱海腸道致病菌污染情況并不清楚。因此，本研究將通過對(duì)洱海下游（西洱河）腸道致病菌噬菌體的檢測(cè)，了解洱海水質(zhì)中腸道致病菌的存在情況，從公共衛(wèi)生角度為洱海治理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料噬菌體分離所用的指示菌為傷寒桿菌、乙型副傷寒桿菌、痢疾桿菌、大腸桿菌，菌種均由大理學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2方法

1.2.1 采集地點(diǎn) 采集地點(diǎn)選擇在洱海下游（西洱河）泰安橋水閘處進(jìn)行采樣檢測(cè)，每次用無菌瓶采集水樣500 mL。

1.2.2 噬菌體的分離 各標(biāo)準(zhǔn)菌株在普通瓊脂培養(yǎng)基上激活2次。取肉湯培養(yǎng)基20 mL（含1 mmol/ L CaCl2），加入標(biāo)準(zhǔn)菌對(duì)數(shù)期菌懸液2 mL（0.5個(gè)麥?zhǔn)蠁挝唬┮詡鋽U(kuò)增噬菌體。取水樣50 mL，0.22μm濾膜濾除水樣中的細(xì)菌，并將濾液加入上述含標(biāo)準(zhǔn)菌懸液的培養(yǎng)基混合培養(yǎng)（37℃振蕩培養(yǎng)24 h）擴(kuò)增噬菌體。培養(yǎng)物12 000 r/min離心30 min，上清液即為噬菌體懸液，加入氯仿60μL備用。取0.1 mL上述噬菌體懸液、0.2 mL對(duì)數(shù)期標(biāo)準(zhǔn)菌懸液（0.5個(gè)麥?zhǔn)蠁挝唬┡c3 mL 50℃的半固體普通瓊脂培養(yǎng)基混合，并快速均勻的鋪在已準(zhǔn)備好的普通瓊脂培養(yǎng)基上（雙層瓊脂法）。37℃培養(yǎng)過夜。次日觀察是否有噬菌斑并記錄結(jié)果，并進(jìn)行單斑分離純化〔3〕。

2 結(jié)果

如有噬菌體存在，可見平板上有噬菌斑形成。噬菌斑在雙層瓊脂平板為細(xì)小、形狀不規(guī)則，透明狀空斑。本研究在洱海水樣中分離出了傷寒桿菌噬菌體、乙型副傷寒桿菌噬菌體、痢疾桿菌噬菌體、大腸桿菌噬菌體。提示洱海下游水體中有相應(yīng)病原體存在。

3 討論

噬菌體（bacteriophage，phage）是一類感染細(xì)菌、真菌、放線菌或螺旋體等微生物病毒的總稱，在1896年-1898年，先后被英國(guó) Hankin和俄國(guó)Gamaleya兩位細(xì)菌學(xué)家發(fā)現(xiàn)并命名〔4〕。噬菌體在自然界分布極廣，凡是有上述微生物的地方，都有相應(yīng)的噬菌體存在〔5〕。噬菌體在數(shù)量上一般是細(xì)菌的10倍左右，被認(rèn)為是地球上數(shù)量最多的病毒類型〔6〕。盡管噬菌體在環(huán)境中廣泛存在，但噬菌體僅侵染某一個(gè)細(xì)菌菌種或侵染一個(gè)細(xì)菌菌種內(nèi)的一或兩個(gè)亞種噬菌體，由于這種嚴(yán)格的宿主特異性〔4〕，噬菌體已用于多種細(xì)菌感染性疾病的診斷和治療〔7-10〕。

由于腸道致病菌較強(qiáng)的傳染性，腸道致病菌引起的各種腹瀉均為國(guó)家法定傳染病〔11〕。常見腸道致病菌噬菌體已在醫(yī)院、城市排污系統(tǒng)等水體中分離成功〔12〕，但在洱海中分離腸道致病菌噬菌體尚未見報(bào)道。由于洱海與周邊及下游居民生活息息相關(guān)，其污染的危害遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其它水體。洱海是大理周邊居民的母親湖，與居民關(guān)系密切，如該水體被腸道致病菌污染，則可致洱海周邊居民和家畜被感染或攜帶致病菌，甚至引發(fā)周邊居民和旅游者腸道傳染病的感染和流行。

因此，本研究分離洱海下游各種腸道致病菌噬菌體，以判斷其遭受腸道致病菌污染的情況。實(shí)驗(yàn)在采集的水樣中分離出大腸桿菌噬菌體、傷寒桿菌噬菌體、痢疾桿菌噬菌體、乙型副傷寒桿菌噬菌體共4種常見腸道致病菌噬菌體，表明該環(huán)境中存在相應(yīng)腸道致病菌，提示洱海下游水體已遭受周邊居民的污染，這與焦春香等〔13〕的結(jié)論相符。洱海水體中這些腸道致病菌的存在將對(duì)周邊人畜飲水安全構(gòu)成威脅，甚至存在小規(guī)模爆發(fā)相關(guān)疾病的可能性。鑒于以上結(jié)果，衛(wèi)生環(huán)保部門應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)城市污水的綜合治理工作，同時(shí)醫(yī)院及基層防疫機(jī)構(gòu)也應(yīng)該加強(qiáng)對(duì)城市居民，尤其是腸道傳染病病人的健康教育，做好糞便的管理，防止對(duì)環(huán)境的污染。

〔1〕徐安倫，董保舉，劉勁松，等.洱海湖濱大氣邊界層結(jié)構(gòu)及特征分析〔J〕.高原氣象，2010，29（3）：637-644.

〔2〕程艷，李柄花，此里能布，等.洱海彌苴河流域降雨侵蝕力特征研究〔J〕.中國(guó)水土保持，2008（6）：29-33.

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〔6〕Weinbauer M G.Ecology of prokaryotic viruses〔J〕.Fems Microbiology Reviews，2004，28（2）：127-181.

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〔8〕劉曉彬，王珂，成伏波，等.噬菌體對(duì)小鼠腸源性銅綠假單胞菌感染的治療作用〔J〕.吉林大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2009，35（4）：660-663.

〔9〕溫占波，李勁松.噬菌體治療細(xì)菌性疾病的研究進(jìn)展〔J〕.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊，2008，32（2）：172-174.

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〔11〕中華人民共和國(guó)傳染病防治法〔S〕.

〔12〕徐焰，熊鴻燕，蘇明權(quán)，等.醫(yī)院內(nèi)污水中噬菌體的及其生物學(xué)特性觀察〔J〕.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，24（9）：846-848.

〔13〕焦春香，劉東平，陶景麗，等.大理洱海水體糞大腸菌群污染狀況初步調(diào)查〔J〕.大理學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，9（8）：29-30.

*通信作者：劉奇，講師.

（責(zé)任編輯 董 杰）

Isolation and Identification of Bacteriophages Specific to Intestinal Pathogen in the Water of Downstream of Erhai Lake

LI Jie,YU Zeying,ZHAO Zongmei,YAN Yijun,MA Zhigang,LIU Qi*
（School of Basic Medicine,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China）

Objective:To investigate the distribution of intestinal bacteria in the downstream of Erhai Lake by isolation and identification phage of intestinal bacteria.Methods:Plaque method was applied to isolate and identify bacteriophages specific to intestinal pathogens in the water of Erhai Lake.Results:Bacteriophages specific to dysentery bacillus,typhoid bacillus,paratyphoid B bacteria,E.coli were successfully isolated.Conclusion:The downstream water of Erhai Lake was contaminated by dysentery bacillus, typhoid bacillus,paratyphoid B bacteria and E.coli.This suggested that it is necessary to further strengthen the management of surrounding living sewage discharge in Dali City.

intestinal pathogen;Erhai Lake;phage

R372

A

1672-2345（2011）12-0097-02

大理學(xué)院大學(xué)生科研基金資助項(xiàng)目（KYSX2010-051）

2011-10-12

李潔，2007級(jí)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)專業(yè)本科學(xué)生.