黃鱔IRF-1和IRF-2保守序列的克隆與表達(dá)

顧琬雯，許巧情，宋 浪，李昊成，袁漢文 （長(zhǎng)江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，湖北荊州434025）

郝立平（湖北信息工程學(xué)校，湖北 荊門448124）

干擾素家族 （interferons，IFNs）是具有一系列多種功能的細(xì)胞因子，它們?cè)诘挚共《?、調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和調(diào)控免疫反應(yīng)方面起著重要的作用。干擾素調(diào)節(jié)因子 （Interferon regulatory factors，IRFs）是在研究干擾素轉(zhuǎn)錄調(diào)控時(shí)發(fā)現(xiàn)的。迄今為止，在脊椎動(dòng)物中共發(fā)現(xiàn)10種干擾素調(diào)節(jié)因子，即IRF-1～I(xiàn)RF-10。它們的主要作用是調(diào)節(jié)干擾素和干擾素誘導(dǎo)基因的表達(dá)[1]。此外，IRFs在造血細(xì)胞分化、免疫基因的調(diào)節(jié)中也發(fā)揮重要的作用[2]，同時(shí)IRFs還參與Toll-like信號(hào)通路和其他的模式識(shí)別受體的免疫反應(yīng)[3]。

魚類作為一類非常重要的脊椎動(dòng)物，對(duì)其免疫基因的研究有助于闡明其免疫機(jī)理和功能。目前，在魚類中已經(jīng)報(bào)道了幾種IRFs的基因組結(jié)構(gòu)和表達(dá)。例如IRF-1在虹鱒 （Oncorhynchusmykiss）[4]、大菱鲆 （Scophthalmusmaximus）[5]、鱖 （Sinipercachuatsi）[6]，IRF-2 在虹鱒[4]和 鱖[7]，IRF-3 在虹鱒[8]，IRF-6在斑馬魚 （Daniorerio）[9]，IRF-7在鱖[6]、虹鱒[8]和大西洋鮭 （Salmosalar）[10]中均有報(bào)道。而IRF-1和IRF-2在黃鱔 （Monopterusalbus）中尚未見任何報(bào)道。黃鱔集約化養(yǎng)殖程度大、種質(zhì)資源退化、養(yǎng)殖水環(huán)境惡化，其病害的發(fā)生率愈來愈高，嚴(yán)重制約著黃鱔養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，而加強(qiáng)對(duì)黃鱔免疫因子的研究可為黃鱔的疾病防治提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

受試黃鱔來自長(zhǎng)江大學(xué)黃鱔養(yǎng)殖基地，體重約100g，在實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)2～3d后用于試驗(yàn)。

1.2 黃鱔RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄

取新鮮的脾臟、中腎、腸等混合組織共100mg，迅速加入Trizol，冰上放置或冷凍于-80℃中。使用Trizol?Reagents提取黃鱔組織總RNA。然后參照Fermentas公司的RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit的方法合成cDNA，分裝保存于-20℃中。

1.3 黃鱔IRF-1和IRF-2cDNA中間序列的擴(kuò)增

根據(jù) NCBI上的鱖 （登錄號(hào)為 AY647431.1）、大黃魚 （Larimichthyscrocea，登錄號(hào)為GU175707.2）、斜帶石斑魚 （Epinepheluscoioides，登錄號(hào)為 GU988700.1）和大西洋鮭 （Salmosalar，登錄號(hào)為CBL58209.1）IRF-1cDNA序列的保守部分設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物IRF-1-F1和IRF-1-R1，擴(kuò)增黃鱔IRF-1cDNA的中間序列 （登錄號(hào)為JN695589）（表1）；根據(jù)NCBI上的牙鲆 （Paralichthysolivaceus，登錄號(hào)為JF312911.1）、虹鱒 （登錄號(hào)為 NM ＿001124438.1）和斜帶石斑魚 （登錄號(hào)為FJ828965.1）IRF-2cDNA序列的保守部分設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物IRF-2-F1和IRF-2-R1，擴(kuò)增黃鱔IRF-2cDNA的中間序列 （登錄號(hào)為JN695590）（表1）。

表1 擴(kuò)增IRF-1／IRF-2cDNA序列以及表達(dá)所用的引物

1.4 系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

利用NCBI上已有的蛋白序列和黃鱔4種IRFs蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，各個(gè)物種蛋白序列的登錄號(hào)見表2。進(jìn)化樹采用MEGA 4.0構(gòu)建。

1.5 黃鱔不同組織和不同發(fā)育階段IRF-1和IRF-2的表達(dá)

1.5.1 RNA的提取

在長(zhǎng)江大學(xué)黃鱔養(yǎng)殖基地選取3個(gè)發(fā)育階段 （雌性、間性和雄性）的黃鱔各3尾，在實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)1周后分別取雌鱔、間性黃鱔、雄鱔的中腎和脾臟組織，迅速加入Trizol，冰上放置，使用Trizol?Reagents提取黃鱔組織總RNA，方法同1.2所述，所得樣本作為研究不同發(fā)育階段表達(dá)之用。取3尾暫養(yǎng)1周后的雄鱔，分別取其新鮮的性腺、肌肉、血液、皮膚、腸、中腎、脾臟、肝臟 腦各100mg，迅速加入Trizol，冰上放置，使用Trizol?Reagents提取黃鱔組織總RNA，方法也同1.2所述，所得樣本作為研究不同組織表達(dá)之用。

1.5.2 RNA樣品中DNA的處理

取2μl溶于DEPC水的RNA，1μl在紫外分光光度計(jì)上測(cè)出RNA樣品的濃度，1μl進(jìn)行電泳，根據(jù)所測(cè)RNA的濃度和電泳結(jié)果，取2μl總RNA用進(jìn)行DNase I處理。反應(yīng)體系為：RNA 2μg，10×DNase I Buffer 2μl，DNase I（RNase-free，1U／μl，F(xiàn)ermentas）2μl，RNase Inhibitor（40U／μl，F(xiàn)ermentas）1μl，DEPC-treated H2O直至20μl。將反應(yīng)液短暫離心以混勻，PCR儀上37℃運(yùn)行30min。然后向離心管加入1μl 25mmol／L EDTA處理65℃，然后立即置于冰上或者-80℃凍存。

1.5.3 cDNA模板的準(zhǔn)備

參照Fermentas公司的RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit的方法合成cDNA，分裝保存于-20℃中。

1.5.4 β-actin、IRF-1和IRF-2基因的擴(kuò)增

利用已測(cè)序驗(yàn)證的IRF-1、IRF-2中間序列設(shè)計(jì)特異引物IRF-1-RT-F2、IRF-1-RT-R2和IRF-2-RT-F2、IRF-2-RT-R2，利用黃鱔β-actin基因 （登錄號(hào)為AY345056.1）設(shè)計(jì)引物β-actin F和β-actin R。

分別采用β-actin F／β-actin R、IRF-1-RT-F2／IRF-1-RT-R2和IRF-2-RT-F2／IRF-2-RT-R2引物對(duì)上述9個(gè)組織或3個(gè)不同發(fā)育階段的中腎和脾臟cDNA模板進(jìn)行擴(kuò)增。取β-actin PCR產(chǎn)物電泳，根據(jù)9個(gè)組織或不同發(fā)育階段的中腎和脾臟電泳條帶強(qiáng)弱調(diào)節(jié)PCR擴(kuò)增后的模板加入體積，直至9個(gè)組織或不同發(fā)育階段的中腎和脾臟6個(gè)樣本的β-actin基因擴(kuò)增條帶亮度基本一致。按照同樣體積的模板量進(jìn)行IRF-1和IRF-2的電泳，揭示黃鱔不同發(fā)育階段或不同組織IRF-1和IRF-2基因的表達(dá)情況。β-actin擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃變性5min；94℃30s，56℃20s，72℃20s，運(yùn)行25個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min；IRF-1和IRF-2擴(kuò)增程序均為：94℃ 變性5min；94℃30s，54℃30s，72℃30s，運(yùn)行35個(gè)循環(huán)。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃鱔IRF-1和IRF-2保守序列及分析

已擴(kuò)增到的IRF-1cDNA長(zhǎng)507bp（GenBank登錄號(hào)：JN695589），編碼168aa（圖1）。IRF-2cDNA長(zhǎng)794bp（GenBank登錄號(hào)：JN695590），編碼264aa（圖2）。

圖1 黃鱔IRF-1的核酸序列和推斷的氨基酸序列 （登錄號(hào)為JN695589）

圖2 黃鱔IRF-2的核酸序列和推斷的氨基酸序列 （登錄號(hào)為JN695590）

利用NCBI上已有的蛋白序列和黃鱔4種IRFs蛋白序列，采用MEGA 4.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果如圖3。從圖3可以看出，各種脊椎動(dòng)物的IRF-2聚集在一起，成為一束，黃鱔IRF-2（MaIRF2）與斜帶石斑魚IRF-2（EcIRF2）最為接近；黃鱔IRF-1（MaIRF1）與鱖 （ScIRF1）和大黃魚 （LcIRF1）最為接近，它們與大西洋鮭 （SsIRF1）和草魚 （CiIRF1）聚集在一起，形成一大束，但斑馬魚IRF-1（DrIRF1）卻與其他魚類的IRF-1相距較遠(yuǎn)，而與所有生物的IRF-1和IRF-2聚合在一起，這說明從進(jìn)化上講IRF-1和IRF-2親緣關(guān)系較近。

2.2 黃鱔不同發(fā)育階段IRF-1和IRF-2的表達(dá)

IRF-1-RT-F2／IRF-1-RT-R2在黃鱔cDNA上擴(kuò)增的片段大小為507bp，β-actin F／β-actin R擴(kuò)增的片段長(zhǎng)度為397bp（圖4A）。從圖4A可以看出，黃鱔3個(gè)不同的發(fā)育階段即雌性、間性和雄性的中腎和脾臟組織IRF-1的表達(dá)量基本一致，無明顯的差別。

IRF-2-RT-F2／IRF-2-RT-R2在黃鱔cDNA上擴(kuò)增的片段大小為577bp，F(xiàn)／β-actin R擴(kuò)增的片段長(zhǎng)度為398bp（圖4B）。圖4B顯示，黃鱔3個(gè)不同的發(fā)育階段即雌性、間性和雄性的中腎和脾臟組織IRF-2的表達(dá)量基本一致，無明顯的差別。

2.3 黃鱔不同組織IRF-1和IRF-2的表達(dá)

黃鱔性腺、肌肉、血液、皮膚、腸、中腎、脾臟、肝臟和腦等組織IRF-1和IRF-2的表達(dá)情況見圖5，其中IRF-1血液、皮膚、腸、中腎和肝臟有明顯清晰的條帶，說明在這5種組織中表達(dá)量較高，其次為性腺、脾臟和腦，而肌肉中表達(dá)量很弱，基本看不到條帶 （圖5A）。中腎的IRF-2條帶最清晰，說明IRF-2的表達(dá)量最高，其次為腸和脾臟，肝臟、腦、血液、皮膚和性腺IRF-2表達(dá)很弱，肌肉中基本看不到明顯的擴(kuò)增條帶，說明IRF-2在肌肉中表達(dá)量很低 （圖5B）。

3 討論

圖3 黃鱔IRF-1和IRF-2與其他脊椎動(dòng)物IRF-1和IRF-2的進(jìn)化關(guān)系

圖4 黃鱔不同發(fā)育階段IRF-1（A）和IRF-2（B）的表達(dá)

干擾素調(diào)節(jié)因子是調(diào)節(jié)干擾素以及干擾素相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄因子[11]。它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)特征上具有保守的序列特征，所有成員前115個(gè)氨基酸同源性較高，具有4～6個(gè)保守間隔排列的色氨酸，具有螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域 （DNA binding domain，DBD）[3]。IRF-1是發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)能在體外激活I(lǐng)型干擾素的干擾素調(diào)節(jié)因子，最初研究表明：IRF-1能夠結(jié)合到IFN-β啟動(dòng)子區(qū)域的正向調(diào)節(jié)區(qū)I，對(duì)IFN-β的轉(zhuǎn)錄起促進(jìn)作用[12]。但進(jìn)一步研究表明，在病毒激活的細(xì)胞質(zhì)I型干擾素產(chǎn)生的通路中并不一定要IRF-1的介導(dǎo)[13]。IRF-2通常被認(rèn)為是一個(gè)轉(zhuǎn)錄抑制因子，對(duì)IRF-1起著拮抗的作用。IRF-2結(jié)合干擾素或干擾素誘導(dǎo)基因的ISRE序列的能力是IRF-1的數(shù)十倍，從而一直這些基因的表達(dá)[14]。

圖5 黃鱔不同組織IRF-1（A）和IRF-2（B）的表達(dá)

魚類IRF-1最早是在牙鲆 （Paralichthysolivaceus）發(fā)現(xiàn)的[15]。從牙鲆cDNA文庫中篩選出一個(gè)長(zhǎng)1746bp的序列，當(dāng)時(shí)命名為fIRF，fIRF與已報(bào)道的鳥和哺乳動(dòng)物的IRF-1和IRF-2相似性達(dá)40%。而且，fIRF的DNA結(jié)合域具有IRF家族最典型的5個(gè)色氨酸殘基。隨后，在其他魚類中開展了大量的研究。利用細(xì)胞巨化病毒介導(dǎo)的增強(qiáng)子構(gòu)建的牙鲆IRF-1重組質(zhì)粒，在同源細(xì)胞系中用轉(zhuǎn)染試驗(yàn)研究牙鲆抗病毒機(jī)制，結(jié)果表明牙鲆IRF-1通過產(chǎn)生類似于細(xì)胞因子的產(chǎn)物來誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)揮抗病毒作用[16-17]。同時(shí)，過量表達(dá)的IRF-1能調(diào)控IFN以及ISG基因的表達(dá)[18]。為了研究IRF-1的抗病毒機(jī)理，亞細(xì)胞定位揭示鯽IRF-1有2個(gè)核定位信號(hào)，它們均能促使IRF-1從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核中，這就充分地闡明了魚類IRF-1在病毒感染前后的遷移規(guī)律。此外，還有學(xué)者對(duì)魚類IRF-1和IRF-2基因的啟動(dòng)子活性進(jìn)行了研究。以虹鱒IRF-1A啟動(dòng)子構(gòu)建的魚類特異性表達(dá)載體pIRF-1A-G，作為DNA疫苗免疫虹鱒后，能在體內(nèi)成功表達(dá)IHNV的G蛋白，使魚體獲得免疫保護(hù)反應(yīng)[19]；Collet等[20]將虹鱒IRF-2基因上游啟動(dòng)子克隆到報(bào)道基因載體pGL3-basic中，通過轉(zhuǎn)染細(xì)胞、熒光素酶活性測(cè)定試驗(yàn)證明IRF-2基因上游啟動(dòng)子具有較強(qiáng)的啟動(dòng)子活性，這些都將有助于進(jìn)一步闡明IRF-1和IRF-2的功能。

IRF-1和IRF-2的表達(dá)規(guī)律已有許多相關(guān)報(bào)道。在其他魚類中，IRF-1和IRF-2廣泛地表達(dá)于各種組織或器官[5，6，21，22]，呈現(xiàn)組成型表達(dá)。本研究表明IRF-1和IRF-2在黃鱔3個(gè)不同發(fā)育階段表達(dá)規(guī)律基本一致，而在檢測(cè)的9種組織中IRF-1血液、皮膚、腸、中腎和肝臟表達(dá)量較高，而IRF-2在中腎、腸和脾臟中表達(dá)量較高，這與大黃魚[23]、斜帶石斑魚[21]、鱖[6]的表達(dá)規(guī)律基本一致，但與牙鲆[15]、虹鱒[4]和紅鰭東方鲀 （Fugurubripes）[24]存在一定差異，這可能是不同的魚類生長(zhǎng)的環(huán)境不同造成的。此外，IRF-1和IRF-2在誘導(dǎo)后表達(dá)量會(huì)顯著上升。牙鲆在輪狀病毒（rotavirus）和遲鈍愛得華氏菌 （Edwardsiellatarda）免疫后，IRF-1mRNA表達(dá)量均得到上調(diào)[15]；虹鱒IRF-1用Poly I：C腹腔注射虹鱒后，鰓、頭腎、肝臟和脾臟中IRF-1表達(dá)量均明顯上升[4]；Poly I：C能鱖魚誘導(dǎo)IRF-2的表達(dá)[7]。這些說明IRF-1和IRF-2在魚類抵抗病原菌的防御中起著十分重要的作用。

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