任興波 李 冀 張軼芬 沈海娥

(河北聯(lián)合大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，①基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 河北唐山 063000;②河北省畜牧良種工作站)

藍氏賈第鞭毛蟲在動物分類學(xué)中屬于原生動物門，鞭毛蟲綱，雙滴蟲目，賈第蟲屬。賈第蟲從細胞及分子水平上來看其是真核生物中最先分支出來的類群，尚不具有線粒體和典型的高爾基氏器，核糖體為70S型，為源真核生物，屬于低等的真核生物，其繁殖方式主要是有絲分裂，在分裂過程中核膜始終不解體，為半開放式分裂。因此關(guān)于賈第蟲滋養(yǎng)體核分裂過程成為近年來研究的熱點，本文從細胞核結(jié)構(gòu)和細胞核分裂兩方面對賈第蟲有絲分裂過程進行綜述。

1 細胞核結(jié)構(gòu)

研究結(jié)果表明，賈第蟲具有典型的真核細胞核特征，在分裂間期具有核被膜、核仁、染色質(zhì)、核纖層等結(jié)構(gòu)。

1．1 核被膜 沈劍釗等［1］在電鏡下觀察核被膜切面圖發(fā)現(xiàn)核被膜具有內(nèi)外兩層膜結(jié)構(gòu)，兩層核膜之間的核周腔很清晰，但是核膜不完整，在核一些地方存在著缺口，并且不止一個。Meredith等［2］觀察賈第蟲發(fā)現(xiàn)，核被膜結(jié)構(gòu)接近完整，在核膜上分散著一定數(shù)量的核孔復(fù)合體。在細胞核分裂期間，核膜仍然存在，

但在細胞核的兩極存在著一些大的缺口，細胞質(zhì)內(nèi)的紡錘體微管通過兩極上的缺口進入細胞核內(nèi)。

1．2 核纖層 在細胞核內(nèi)膜之下存在著一層纖維蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，并與核內(nèi)膜結(jié)合，這層結(jié)構(gòu)就是賈第蟲的核纖層。它起著維持細胞核形狀和大小、保持核膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的作用，在細胞進行有絲分裂時，核纖層還參與了核膜崩解和重建、核孔復(fù)合體的錨定、染色質(zhì)的組織及DNA的復(fù)制。

1．3 核仁 賈第蟲作為源真核生物，其核仁的有無問題一直受到國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。李靖炎等［3，4］通過對賈第蟲的研究，結(jié)果顯示賈第蟲并沒有核仁。陳泳宏等［5］觀察了用核銀染技術(shù)染色的賈第蟲細胞核發(fā)現(xiàn)，銀粒散布在整個細胞核中，沒有大量聚集的銀粒出現(xiàn)，這間接表明rDNA并未在核中形成核仁組織區(qū)，但是rDNA的轉(zhuǎn)錄活動集中在核內(nèi)進行。田喜鳳等［6］通過半薄切片定位，在電鏡下觀察大量的賈第蟲超薄切片，發(fā)現(xiàn)賈第蟲滋養(yǎng)體在間期具有典型的核仁，并通過間接免疫熒光法進一步驗證賈第蟲具有典型的核仁，在分裂期核仁消失。

2 細胞核分裂的同步性

賈第蟲滋養(yǎng)體的2個細胞核是否同時進行DNA的復(fù)制和分裂存在著一些爭議。Filice在1952年提出鼠梨形鞭毛蟲的2個細胞核分裂不是同步的［7］。1984年，Wiesehahn等利用3H－胸腺嘧啶核苷滲入法和放射自顯影技術(shù)觀察研究無菌培養(yǎng)的賈第蟲滋養(yǎng)體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2個細胞核的DNA的復(fù)制前后相差15～30分鐘，在復(fù)制期(S期)有 70% 的重合［8］。隨后 Marlene Benchimol通過電子顯微鏡、Panotic染色、免疫熒光顯微鏡等方法觀察分裂的蟲體細胞，發(fā)現(xiàn)部分細胞具有3個細胞核，這就間接證明了2個細胞核分裂不是同步的，第1次和第2次細胞核分裂之間有一個短暫的停頓［9］。以上研究結(jié)果均表明2個細胞核的分裂不是同步的。但在1990年，Kabnick與 Peattie利用DAPI進行細胞核染色，在熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)部分細胞具有4個細胞核，但沒有發(fā)現(xiàn)有3個細胞核的情況［10］。Meredith等在熒光顯微鏡下觀察4’，6－二脒基－2－苯基吲哚染色(DAPI染色)的細胞核，也沒有發(fā)現(xiàn)有3個細胞核的情況［11］，所以有關(guān)2個細胞核是否同時進行復(fù)制和分裂還需進一步研究。

3 細胞核分裂過程

賈第蟲滋養(yǎng)體在核分裂過程中，核膜始終存在，但核膜上存在缺口，呈現(xiàn)半開放式分裂。應(yīng)用超薄切片和纖維免疫技術(shù)，在光學(xué)顯微鏡、透射顯微鏡下觀察賈第蟲滋養(yǎng)體核分裂過程，根據(jù)染色體的形態(tài)變化將分裂過程分為前期、中期、后期和末期。前期:分裂間期核內(nèi)大的異染色體塊消失，染色質(zhì)凝集形成細長的染色質(zhì)絲，分布在核膜的內(nèi)側(cè)，并且紡錘體微管成核。中期:2個細胞核內(nèi)均形成高度凝集的典型中期染色體，染色體成短棒狀，體積微小約0．76μm，全部排在細胞核的中央或以多條棒狀結(jié)構(gòu)分散在核內(nèi)，圍繞著每一個細胞核的微管形成了2組獨立的兩極紡錘體，染色質(zhì)緊緊地聚集在紡錘體軸中心部位以至于不能分清單個染色體。后期:2個細胞核明顯拉長，姐妹染色單體分開，在紡錘體的牽引下向細胞兩極移動，細胞核在外形上表現(xiàn)為核沿著細胞左右軸延長。末期:核膜向中間溢束呈葫蘆狀，每個細胞核縊裂成2個子細胞核，有時可見2個細胞核分裂不同步，一個細胞核先溢束，而另一個細胞核處于拉長狀態(tài);然后先溢束的細胞核分裂的2個子細胞核，另一個細胞核仍處于溢束階段，這時，在細胞內(nèi)可見3個細胞核。細胞核分裂結(jié)束后，染色體解螺旋形成染色質(zhì)，每個細胞內(nèi)可見4個細胞核［12］。

在分裂過程中是否有紡錘體的形成與參與也存在爭議。沈劍釗等［13］利用秋水仙素作用于處于有絲分裂的賈第蟲的細胞核，發(fā)現(xiàn)秋水仙素對細胞分裂并無阻抑作用，說明賈第蟲細胞核分裂過程中，細胞核內(nèi)并無紡錘體的形成與參與。沈海娥等［14］通過反復(fù)試驗發(fā)現(xiàn)，秋水仙素可在一定程度上阻抑細胞分裂停止在中期，但相比其他真核生物效果較差。Meredith等［2］利用三維共聚焦顯微鏡、熒光標記、免疫定位等技術(shù)對賈第蟲有絲分裂過程進行研究，發(fā)現(xiàn)在核分裂過程中在細胞質(zhì)中具有核外紡錘體，紡錘體微管通過細胞核兩極的缺口進入核內(nèi)連接在染色體上，并牽引姐妹染色單體向細胞核的兩極移動，從而完成姐妹染色體單體的分離，保證了染色體在子細胞核內(nèi)的平均分布。

4 核分裂中期的染色體

4．1 染色體的大小及數(shù)目 Adam等［15］根據(jù)脈沖場凝膠電泳的賈第蟲全基因組DNA分析，依據(jù)電泳條帶結(jié)果推測出賈第蟲滋養(yǎng)體每個細胞核內(nèi)至少有4～5條功能緊密相關(guān)的大分子染色體DNA片斷，顯示各染色體大小不一，并推測其為多倍體，但對染色體的形態(tài)未做詳細的描述。Filice等［7］利用光鏡觀察賈第蟲滋養(yǎng)體發(fā)現(xiàn)在每一個細胞核內(nèi)染色體數(shù)目為4條。Kabnick等［10］利用熒光染色體原位雜交技術(shù)研究顯示賈第蟲的2個細胞核有相同數(shù)量的DNA，結(jié)果顯示賈第蟲滋養(yǎng)體每個細胞核內(nèi)有4條染色體。Fan等［16］用密度掃描法觀察經(jīng)限制性酶解的賈第蟲DNA片段，顯示其染色體數(shù)目為5條，為單倍體。Upcroft等［17］利用倒轉(zhuǎn)電場凝膠電泳(FIGE)顯示不同地理株賈第蟲在650～800bp范圍內(nèi)，有3～4條染色體帶型。Zhi Yu等［18］通過熒光原位雜交技術(shù)推測賈第蟲的2個細胞核基因組相同，都為二倍體，染色體數(shù)目為2n=10。Bernander等［19］利用流式細胞儀和熒光顯微鏡研究顯示，賈第蟲滋養(yǎng)體的每個細胞核都不是單倍體，而是二倍體。沈海娥等［14］通過觀察大量的染色體玻片標本，確認賈第蟲滋養(yǎng)體的染色體數(shù)目為10條，為二倍體。

4．2 染色體的形態(tài) 各國學(xué)者很早就對賈第蟲染色體方面進行了研究。Filice等［7］利用光鏡對賈第蟲染色體進行觀察，發(fā)現(xiàn)賈第蟲的染色體呈線形。沈劍釗等［13］利用電鏡觀察表明，賈第蟲滋養(yǎng)體在分裂過程中，并沒有出現(xiàn)像真核生物一樣的濃聚的典型中期染色體。沈海娥等［14］利用光鏡和電鏡觀察了大量的賈第蟲染色體玻片標本，發(fā)現(xiàn)賈第蟲具有典型的中期染色體形態(tài)，染色體呈短桿狀，形態(tài)相近，常成對排列。沈海娥等［20］對賈第蟲染色體進行了核型研究，確定賈第蟲滋養(yǎng)體的平均長度為0．76μm，為微小染色體，染色體數(shù)目為2n=10。該核型中1號染色體為亞中央著絲粒染色體，2～5號為端著絲粒染色體。其核型公式是2n=10=2sm+8t。

賈第蟲主要以有絲分裂作為其繁殖方式，但在分裂過程中核膜始終不解體、分裂周期快、同步化較困難，加之蟲體微小，因此關(guān)于賈第蟲滋養(yǎng)體細胞核分裂的過程及機制還存在很多問題，比如2個細胞核是否同步分裂，細胞核分裂調(diào)控機制如何，這些問題都需要我們進一步研究。

［1］沈劍釗，李靖炎，盧思奇．藍氏賈第蟲核被膜缺口的電鏡觀察［J］．動物學(xué)研究，1996，17(3):291

［2］Meredith SSagolla，Scott C Daw so，Joel JMancus o，et al．Three －dimensional analysis ofmitosis and cytokinesis in the binucleate parasite Giardia intestinalis［J］．JCell Sci，2006，119(23):4889

［3］Li JY．Characterozation of Giardia cell nucleus:its implication on the nature and origin of the primitive cell nucleus［J］．Cell Res，1995，5(1):115

［4］Li JY，He Y H，Chen SF．The primitive cell nucleus，in which nucleolus has not emerged yet［J］．Endosyt obiosis ＆ Cell Res，1997，12:65

［5］陳永宏，郭 建，李靖炎，等．無核仁原生動物藍氏賈第蟲 rDNA的分布［J］．動物學(xué)雜志，2002，37(5):2

［6］Xi Feng Tian，Zhi Hong Yang ，Haie Shen，et al．Identification of the nucleoliof Giardia lamblia with TEM and CFM［J］．Parasitol Res，2010，106(4):789

［7］Filice FP．Studies on the cytology and life history of a Giardia from the laboratory rat［J］．Univ．Calif．Public．Zool，1952，57:53

［8］Wiesehahn G P，Jarrol E L，Lindmark D G．et al．Giardia lamblia:autoradiographic analysis of nuclear division［J］．Exp Parasitol，1984，58(1):94

［9］Marlene B．Participation of the adhesive disc during karyokinesis in Giardia lamblia［J］．Biol Cell，2004，96(4):291

［10］Kabnick K S，and Peattie DA．Insitu analyses reveal that the two nuclei of Giardia lamblia are equivalent［J］．Cell Sci，1990，95(3):353

［11］Meredith SS，Scott CD，Joel JM，etal．Three － dimensional analysis ofmitosis and cytokinesis in the binucleate parasite Giardia intestinalis［J］．JCell Sci，2006，119(23):4889

［12］李 冀，沈海娥，邵 薇，等．藍氏賈第鞭毛蟲滋養(yǎng)體有絲分裂的初步觀察［J］．中國人獸共患病學(xué)報，2010，26(4):370

［13］沈劍釗，李靖炎，盧思奇．源真核生物藍氏賈第蟲核分裂的初步觀察［J］．動物學(xué)研究，1996，17(3):295

［14］沈海娥，李 冀，田喜鳳，等．藍氏賈第鞭毛蟲染色體核型初步觀察［J］．中國人獸共患病學(xué)報，2009，25(4):352

［15］Adam RD，Nash TE，Wellems TE ．The Giardia lamblia trophozoite contains sets of closely related chromosomes［J］．Nucleic Acids Res，1988，16(10):4555

［16］Fan JB，Korman SH，Canter CR，etal．Giardia lamblia，hapoid genome sized etermined by pulsed field gelelect rophoresis is less than 12Mb［J］．Nucleic Acids Res，1991，19:1905

［17］Upcroft JA，Healey A，Upcroft P．Chromosomal duplication in Giardia duodenalis［J］．International Journal for Parasitology，1993，23(5):609

［18］Li Zhi Yu，C．William Birky，Jr．，et al．The Two Nuclei of Giardia Each Have Complete Copies of the Genome and Are Partitioned Equationally at Cytokinesis［J］．EUKARYOTIC CELL，2002，1(2):191

［19］Bernander R，Palm JE，Svard SG．Genome ploidy in different stages of the Giardia lamblia life cycle［J］．Cell Microbiol，2001，3(1):55

［20］沈海娥，李冀，路瑤，等．藍氏賈第鞭毛蟲滋養(yǎng)體染色體掃描電鏡觀察［J］．中國人獸共患病學(xué)報，2010，26(7):696