馮 超，蔣麗娟，黎繼烈，郝聚喜

（中南林業(yè)科技大學(xué)，湖南長沙410004）

固定化脂肪酶研究進(jìn)展

馮 超，蔣麗娟，黎繼烈*，郝聚喜

（中南林業(yè)科技大學(xué)，湖南長沙410004）

固定化脂肪酶由于其易與底物分離且可重復(fù)使用而備受關(guān)注。綜述了常用的固定化方法，包括物理吸附法、共價(jià)交聯(lián)法和包埋法，不同的固定化方法對(duì)酶的性質(zhì)有不同的影響。

固定化，脂肪酶，載體

1 固定化脂肪酶的方法

1.1 物理吸附法

物理吸附是最簡單的固定化方法，利用離子鍵或吸附作用將酶固定到載體上，操作相對(duì)簡單，很少用到有機(jī)試劑。

高陽［6］等以不同大孔樹脂吸附法固定化假絲酵母99-125脂肪酶，在微水有機(jī)相中的應(yīng)用表明，非極性樹脂NKA是最佳的固定化載體。結(jié)果表明，在給酶量為1.92∶1（初始酶粉與樹脂的質(zhì)量比），pH為7.4，體系水含量為15%（水與油的質(zhì)量比），反應(yīng)溫度為40℃條件下，固定化酶具有最佳的催化能力。固定化酶連續(xù)反應(yīng)19批以后，生物柴油的轉(zhuǎn)化率仍然保持為 70.2%，固定化酶的酶活為初始值的85.1%，顯示出固定化酶具有良好的操作穩(wěn)定性。

李南薇［7］等從20種不同來源的樹脂中篩選出固定化效率高且價(jià)格低廉的D4020樹脂作為載體，系統(tǒng)研究了固定化條件對(duì)固定化效率及固定化酶轉(zhuǎn)酯活力的影響。結(jié)果表明，最適加酶量、緩沖液pH和吸附時(shí)間分別為0.7g/g、9.4和4h，固定化酶的轉(zhuǎn)酯活力為404.0U/g，而所用的游離酶不能催化該轉(zhuǎn)酯反應(yīng)。

王冰［8］等以沙蒿多糖-殼聚糖復(fù)合磁性微球?yàn)檩d體，采用物理吸附法固定化脂肪酶，對(duì)固定化過程中對(duì)酶活力有影響的各種因素進(jìn)行研究，同時(shí)對(duì)固定化酶的部分理化性質(zhì)、最適pH、最適溫度、酶的熱穩(wěn)定性以及表觀米氏常數(shù)與游離酶做了比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：固定化脂肪酶的最佳條件為每0.1g載體加2%（w/v）的酶溶液0.9mL，固定8h，pH8.4，溫度為50℃。固定化酶的Km小于游離酶的Km，其最適pH和最適溫度分別為8.0和50℃，而且固定化脂肪酶具有良好的熱穩(wěn)定性、可應(yīng)用性和重復(fù)使用性。

縱偉［9］等以磁性殼聚糖微球?yàn)檩d體，用物理吸附法固定化脂肪酶，對(duì)影響固定化的各種因素進(jìn)行考察，確定其最優(yōu)條件，并比較游離酶和固定化酶的pH和熱穩(wěn)定性，研究固定化酶的使用穩(wěn)定性，固定化的最適宜條件為采用加酶量600U/g，溫度5℃，pH7.0，固定時(shí)間2h，固定化酶的pH和熱穩(wěn)定性都優(yōu)于游離酶，固定化酶連續(xù)使用5次，其相對(duì)酶活仍為使用前的57.8%，具有較好的操作穩(wěn)定性。

1.2 共價(jià)交聯(lián)法

共價(jià)交聯(lián)法取決于酶分子與其他物質(zhì)之間的共價(jià)鍵，通常在載體上加入氨基、醛基等功能性集團(tuán)來使酶結(jié)合得更牢固。使載體活化的方法很多，主要有重氮法、迭氮法、溴化氰法和烷化法等［1］。

劉新喜［10］等用蛋殼作載體固定化脂肪酶，其工藝條件為：酶用量為 0.12g/g，攪拌吸附時(shí)間為30min，在pH為6.2、室溫下得到的固定化酶的最大活力29.41U/g，該固定化酶最適用的溫度為35℃，pH為9.0，重復(fù)使用6次后活力仍保留53%。

Neerupma Nawani［11］等將脂肪酶用戊二醛交聯(lián)到HP-20微球上，得到的固定化酶的最適pH幾乎與游離酶相同（pH8.5），而固定化酶的最適溫度比游離酶高5℃，交聯(lián)的酶在80℃時(shí)更穩(wěn)定。

M.G.Carneiro-da-Cunha［12］等將脂肪酶通過活化劑（高碘酸鈉或碳二亞胺）固定到由纖維素、纖維素衍生物及纖維素復(fù)合材料（纖維素醋酸鹽和纖維素酯）薄膜上，獲得的最大酶活為17.5!mol/s·m2。

Seong-Ho Choi［13］等在不同的實(shí)驗(yàn)條件下將脂肪酶固定到含環(huán)氧基的聚（甲基丙烯酸縮水甘油酯）-聚乙烯微球上，固定化酶的活力為160～500U/mg·min，固定化酶活力隨環(huán)氧基濃度的增加而增加。

羅文［14］等以多孔玻璃珠預(yù)處理后，用有機(jī)硅烷衍生化后再用戊二醛活化作為載體，采用共價(jià)法對(duì)假絲酵母99-125脂肪酶進(jìn)行了固定，對(duì)比了固定化酶與游離酶的最適反應(yīng)溫度、pH以及熱穩(wěn)定性。并以所制備的固定化酶為催化劑，在微水體系中利用菜籽油合成生物柴油，考察了溶劑量、體系水含量、甲醇等因素對(duì)固定化酶催化性能的影響，研究了固定化酶的操作穩(wěn)定性。固定化脂肪酶的半衰期在390h以上，此固定化脂肪酶具有良好的操作穩(wěn)定性。

1.3 包埋法

包埋法是不需要化學(xué)修飾酶蛋白的氨基酸殘基，反應(yīng)條件溫和，很少改變酶結(jié)構(gòu)的固定化方法。其基本原理是單體和酶溶液混合，再借助引發(fā)劑進(jìn)行聚合反應(yīng)，將酶固定于載體材料的網(wǎng)格中［15］。包埋法包括凝膠包埋法和微囊化法。

楊本宏［16］等研究了以海藻酸鈉為載體，用包埋法制備固定化德氏根霉（Rhizopus delemar）脂肪酶的條件。將酶粉和海藻酸鈉溶于pH5.0的HAc-NaAc緩沖溶液，用注射器將此混合液滴入到0.05mol/L無菌CaCl2溶液中，靜置固化45min，經(jīng)過濾、洗滌和干燥后得到球狀固定化酶。固定化酶的活力回收約為34.1%。酶學(xué)性質(zhì)研究表明，此固定化酶的熱穩(wěn)定性較好。游離酶在60℃下保溫1h已完全喪失活力，而固定化酶在100℃下保溫1h僅損失36.2%的活力，在100℃下保溫6h仍可保持46.8%的酶活力。酶經(jīng)固定化后，其橄欖油水解反應(yīng)的最適溫度由40℃上升至90℃，Km值由13.8mg/mL降為8.1mg/mL。常見有機(jī)溶劑對(duì)固定化酶的活力影響較小。將該固定化脂肪酶用于非水溶劑中正戊酸異戊酯的合成，重復(fù)使用6次后，固定化酶仍保持95%的酶活力。

王愛玲［17］等以海藻酸鈉明膠為復(fù)合載體，采用包埋法制備固定化黑曲霉脂肪酶，考察了海藻酸鈉、明膠濃度等因子對(duì)固定化效果的影響，比較固定化酶和游離酶對(duì)溫度、pH等條件的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，制備固定化黑曲霉脂肪酶的最優(yōu)條件為：海藻酸鈉、明膠濃度分別為1.25%和0.5%，CaCl2濃度為10%，給酶量為450U/g，固定化酶最適溫度為35℃，最適pH為9.0。

1.4 其它方法

黃磊［18］等考察了泡沫陶瓷的孔徑分布和表面性質(zhì)對(duì)脂肪酶固定化的影響。泡沫陶瓷用硅烷偶聯(lián)劑對(duì)其進(jìn)行表面改性處理后，成功地應(yīng)用于脂肪酶的固定化。研究表明，泡沫陶瓷的納米孔孔徑分布非常適合脂肪酶的固定化，對(duì)固定化酶的催化效率有決定性的影響。經(jīng)1h的固定化，泡沫陶瓷固定化酶的活性達(dá)商業(yè)化硅藻土固定化酶的1.33倍，體積活力為其2.63倍，蛋白載量為45.36mg/g陶瓷，比活為1215.39U/g，活力回收為41.2%。

曾淑華［19］等利用以四甲氧基硅烷（TMOS）和甲基三甲氧基硅烷（MTMS）為前驅(qū)體的溶膠-凝膠法（sol-gel）固定洋蔥假單胞菌屬脂肪酶，考查了固定化酶和游離酶的酶學(xué)性質(zhì)及催化不同油脂酯交換合成生物柴油的情況。結(jié)果表明，80℃以下固定化酶能保持80%以上的酶活，而游離酶在50℃以后活力急劇下降，到80℃殘余酶活約為10%；固定化酶在體積分?jǐn)?shù)50%的甲醇中處理48h能保持85%的酶活，在體積分?jǐn)?shù)90%的乙醇中處理48h能保持31%的酶活，而游離酶殘余酶活只有69%和0；在酯交換反應(yīng)中固定化酶的催化效率比游離酶高10%～20%，且固定化酶重復(fù)使用11次后仍能保持60%的酶活。結(jié)果顯示，酶經(jīng)過固定化后穩(wěn)定性和催化活性顯著提高。

劉勇［20］等研究了吸附-絮凝耦合的方法固定脂肪酶的工藝條件。結(jié)果表明：在33℃下，用0.03mol/L的磷酸二氫鉀緩沖液控制體系pH為7.0，酶與樹脂（質(zhì)量比1∶8）作用吸附1h后，用0.2mL絮凝劑聚丙烯酰胺（wPAM=0.5%）處理，得到活力較高的固定化脂肪酶。固定化酶最適pH9.0，最適溫度為45℃，活力為405U/g，酶活回收率可以達(dá)到40%。固定化脂肪酶制備簡便，可重復(fù)使用，穩(wěn)定性較高。

Katsuya Kato［21］等通過溶膠-凝膠的方法將脂肪酶固定到無機(jī)材料上來合成手性化合物，用乙烯基三乙氧基硅烷制得的溶膠-凝膠脂肪酶在水溶液中有高的水解活性。

Gabriela Kuncová［22］等通過將脂肪酶加入到含有有機(jī)-無機(jī)的溶膠-凝膠基質(zhì)的前體溶液中固定到鐵酸鹽粉末上。固定脂肪酶和鐵酸鹽粉末的最佳前體溶液的組成是含有功能化的氨基和烷基的硅烷，有機(jī)的交聯(lián)如戊二醛和聚乙烯醇并不會(huì)提高其活力和載體的機(jī)械強(qiáng)度。

Roila Awang［23］等將脂肪酶固定到先用聯(lián)合固定劑（包括卵磷脂、膠質(zhì)、聚乙烯、乙二醇、氯化鎂）浸濕的以棕櫚為基質(zhì)的聚亞胺酯泡沫上，固定化酶的活力通過在己烷中的油酸或油醇的轉(zhuǎn)酯反應(yīng)測(cè)得。天然酶和固定化酶的最適溫度均為40℃，說明固定化并沒有改變脂肪酶的一般性質(zhì)，該固定化酶至少可以重復(fù)使用四次。

李麗麗［24］等以米糠為原料，研究了米糠固定化脂肪酶的制備及生化性質(zhì)。結(jié)果表明：米糠經(jīng)過一定的處理后，不僅能獲得米糠中油脂，且能保留米糠脂肪酶的活性，形成一種以米糠為天然載體的米糠固定化脂肪酶（immobilized rice-bran lipase，IRB-L），且以石油醚在35℃下去脂5min得到的IRB-L的活動(dòng)度最高，約為10.72mL/g。該酶在催化油脂水解反應(yīng)中，最適水解溫度約為40℃，最適pH為7.0。在催化油脂酯化反應(yīng)中，最優(yōu)條件為IRB-L與油酸的質(zhì)量比為60%，甲醇與油酸摩爾比1∶1，反應(yīng)溫度40℃，反應(yīng)時(shí)間6h；在上述條件下，產(chǎn)物油酸甲酯得率可達(dá)44.98%。且該酶在40℃的環(huán)境中保存40d可維持80%以上的活性，在批次水解反應(yīng)下重復(fù)使用5次之后，殘余酶活力仍達(dá)62%。

2 存在的問題與展望

2.1 存在的問題

很多固定化方法在單獨(dú)使用的時(shí)候往往有其缺點(diǎn)所在，吸附法中由于酶與載體之間的作用力弱，改變溫度、pH、離子強(qiáng)度等條件，酶就可能從載體上解離下來。吸附法的另一個(gè)缺點(diǎn)是其他物質(zhì)也可能非特異性吸附到載體上，這就可能改變固定化酶的性質(zhì)并影響酶的吸附量。共價(jià)交聯(lián)法過程較復(fù)雜，化學(xué)試劑的使用使酶在處理過程中易失活，有機(jī)溶劑和金屬離子對(duì)酶的活性會(huì)有一定的影響。包埋固定化酶易流失。另外，納米級(jí)材料的應(yīng)用中，載體的機(jī)械性和操作過程中載體的損失等問題也有待解決。在實(shí)際的應(yīng)用過程中常將幾種方法聯(lián)用。

2.2 展望

脂肪酶在食品、洗滌劑、制藥等方面應(yīng)用廣泛。由于固定化酶的制備方法過于復(fù)雜，效率低、成本高，以及化學(xué)試劑的使用易使酶活力降低或失活等因素的制約，固定化酶在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用受到限制。尋找廉價(jià)、易于活化和制備的載體是脂肪酶固定化發(fā)展的一個(gè)方向。另外，由于酶的活性與其所處的微環(huán)境有關(guān)，改善其反應(yīng)的微環(huán)境可能會(huì)提高其活力。但隨著生物技術(shù)以及材料、化工等各相關(guān)學(xué)科的發(fā)展，新型載體的開發(fā)利用及各種固定方法的發(fā)展完善，相信固定化脂肪酶的工作會(huì)有新的突破。

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Research progress in lipase immobilization

FENG Chao，JIANG Li-juan，LI Ji-lie*，HAO Ju-xi
（Central South University of Forestry and Technology，Changsha 410004，China）

Immobilized lipase became a hotspot because its easy to separate and can be reused.The common immobilization methods were generally introduced including physical adsorption，covalent cross-linking method and entrapment method.Different immobilization methods had different effects on the enzyme.

immobilization；lipase；carrier

TS201.2+3

A

1002-0306（2011）02-0373-04

脂肪酶（Lipase EC3.1.1.3，甘油酯水解酶）是一類特殊的酰基水解酶，它的底物是油脂，其水解部位是油脂中脂肪酸和甘油相連接的酯鍵［1］；脂肪酶能在油-水界面上催化酯水解或醇解、酯合成、酯交換、內(nèi)酯合成、多肽合成、高聚物合成及立體異構(gòu)體拆分等有機(jī)合成反應(yīng)，是目前被重點(diǎn)研究的酶催化劑［2］。脂肪酶與底物的作用過程包括：第一步，活化絲氨酸的?；ㄍㄟ^親核攻擊）和酯鍵裂解，甘油二酯釋放后，四面體半縮醛中間產(chǎn)物形成；第二步，脫?；饔茫ńz氨酸酰基化的逆反應(yīng)），是活化水分子對(duì)酯進(jìn)行攻擊，接下來的裂解過程同樣包括脂肪酸釋放后四面體半縮醛中間產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的形成［3］。游離脂肪酶催化技術(shù)雖然成熟，但酶分離困難，不能重復(fù)使用，難以實(shí)現(xiàn)過程連續(xù)化，因此脂肪酶催化技術(shù)工業(yè)化很大程度上取決于酶的固定化［4］。當(dāng)?shù)孜锖彤a(chǎn)物是小分子的可溶性物質(zhì)時(shí)，固定化酶更占優(yōu)勢(shì)。所謂固定化酶就是指在一定空間內(nèi)呈閉鎖狀態(tài)存在的酶。固定化酶的兩個(gè)最大的優(yōu)點(diǎn)是酶易與產(chǎn)物分離，可重復(fù)使用。通過固定化操作，可以改變酶的一些性質(zhì)，例如Michiaki Matsumoto等［5］將脂肪酶固定到海藻酸鈉凝膠、硅酸鈉微囊及大孔樹脂上來研究其耐熱性，在60℃時(shí)，固定在海藻酸鈉凝膠中的固定化酶有更好的穩(wěn)定性，而在60℃以上時(shí)，微囊固定的酶更穩(wěn)定。說明固定化的不同方法以及載體與酶之間的結(jié)合能力對(duì)酶的性質(zhì)有些影響。本文綜述了固定化脂肪酶的研究現(xiàn)狀及存在的問題，以期為脂肪酶的研究提供新的思路。

2010-02-26 *通訊聯(lián)系人

馮超（1985-），女，碩士研究生，主要從事生物新能源的研究。

國家科技支撐計(jì)劃（2007BAD41B06）。