孫中文，黃靜芳，陶 鴻，易麗嫻，孫 靜，肖 洋

(1蘇州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學院，江蘇蘇州215009;2蘇州市檢驗醫(yī)學生物技術(shù)重點實驗室)

GL50分子作為B7家族的新成員，主要表達于樹突狀細胞(DC)、單核細胞、巨噬細胞和B細胞等抗原遞呈細胞(APC)表面，參與T、B細胞的活化、分化和凋亡等［1～3］。近年研究證實，在關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)腔T細胞、系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的外周血T細胞、DC與T細胞共培養(yǎng)后的T細胞表面均可檢測到 B7家族 B7-1的表達［4，5］。2010年3～6月，我們對GL50分子在活化T細胞表面的誘導性表達及其生物學意義進行了初步探討，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 牛血清，RPMI1640基礎培養(yǎng)基，健康人外周血T細胞，GL50單抗(本科室自制)，激發(fā)型CD3單抗、CD28單抗，鼠抗人 CD3單抗，Avidin-PE，Trizol，3H-TdR，淋巴細胞分離液 Ficoll;RT-PCR試劑盒，CO2培養(yǎng)箱，離心機，倒置顯微鏡及熒光顯微鏡，液體閃爍計數(shù)儀，流式細胞儀，RT-PCR儀;引物設計與合成由上海生工生物公司完成。

1.2 活化T細胞表面GL50分子陽性率測定 分別取不同時相(24～144 h)激發(fā)型CD3單抗聯(lián)合CD28單抗活化的T細胞，用PBS洗滌2遍后分裝于小試管中(5×105/管)，加入Biotin標記的GL50分子單克隆抗體各10 μl及小鼠IgG-PE 10 μl作為陰性對照，于4℃反應45min，充分洗滌后加入Avidin-PE 10 μl，于 4 ℃反應 45min，充分洗滌后采用流式細胞儀分析GL50分子陽性表達情況，同時以靜止T細胞為對照。

1.3 活化T細胞表面GL50分子mRNA轉(zhuǎn)錄水平測定 分別取不同時相(24～144 h)激發(fā)型CD3單抗聯(lián)合CD28單抗活化的T細胞，洗滌后采用Trizol一步抽提法抽提總RNA，加入隨機引物和逆轉(zhuǎn)錄酶利用常規(guī)方法合成 cDNA。PCR反應體系為50 μl，IQ SYBR Green supermix 25 μl，上下游引物各 0.5 μl，cDNA 5 μl，PCR反應條件為94 ℃ 2min預變性，94℃ 40 s、56℃ 50 s、72℃ 1min，共40個循環(huán)。以βactin為內(nèi)參照，常規(guī)PCR反應條件擴增目的DNA，擴增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，紫外透射儀觀察電泳結(jié)果;以RT-PCR儀進行分析。

1.4 阻斷GL50信號對T細胞增殖影響的測定鼠抗人CD3單抗包被96孔培養(yǎng)板，100 μl/孔，4℃過夜，吸去包被液，PBS洗滌2遍。用含15%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基將活化T細胞調(diào)整為5×105/ml并隨機分為A、B、C、D四組，其中A組為空白對照;其余三組分別加入終質(zhì)量濃度為1 μg/ml CD3單抗、CD3單抗 +CD28單抗、CD3單抗 +CD28單抗 +GL50單抗，充分混勻后接種于96孔板(100 μl/孔)，活化24 h后分別加入終質(zhì)量濃度為5 μg/ml的阻斷性鼠抗人GL50單抗;3 d后加入3H-TdR(3.7×104Bq/孔)，繼續(xù)培養(yǎng)18 h后收獲細胞，液閃儀測定細胞增殖抑制率。所有實驗組均設3個復孔。實驗結(jié)果以測定cpm均值表示。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學處理。計數(shù)資料比較行χ2檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 活化T細胞表面GL50分子陽性表達率及mRNA轉(zhuǎn)錄水平 ①陽性表達率:靜止T細胞表面未檢測到GL50分子表達;GL50分子陽性表達率在T細胞活化后24 h為17.2%、48 h為49.4%、72 h為82.5%、96 h為93.5%、120 h為95.7%、144 h為91.9%。②mRNA轉(zhuǎn)錄水平:T細胞活化24～144 h均有GL50分子mRNA誘導性表達上調(diào)，靜止T細胞未檢測到GL50分子mRNA表達。

2.2 阻斷GL50分子信號后活化T細胞的增殖抑制情況 A組未出現(xiàn)T細胞明顯增殖、B組出現(xiàn)T細胞輕度活化增殖、C組呈現(xiàn)快速增殖、D組T細胞增殖速度受到抑制，其T細胞增殖抑制率(cpm均值)分別為 217、452、37 329、22 168，D 組顯著高于C組(P＜0.01)。

3 討論

隨著對共刺激分子研究的不斷深入，新的B7家族成員不斷被發(fā)現(xiàn)，這些分子主要表達于DC、單核細胞、朗格漢斯細胞、巨噬細胞和B細胞等抗原遞呈細胞(APC)表面，參與抗原的處理和遞呈。但近年實驗研究證實，活化T淋巴細胞亦有部分B7家族分子表達，此使免疫應答的精確性調(diào)節(jié)變得更為復雜。本研究顯示，激發(fā)型CD3單抗聯(lián)合CD28單抗活化T細胞后24 h即可檢測到GL50分子陽性表達，隨后逐漸升高至活化120 h時達最大陽性率，并維持至活化144 h時基本不變;T細胞活化24～144 h均可檢測到GL50分子mRNA表達。提示GL50分子在活化T細胞表面的表達為內(nèi)源性上調(diào)所致(即均為誘導性表達)，并非來源于樹突狀細胞表面B7 家族分子向 T 細胞的轉(zhuǎn)移［6，7］。

本研究還顯示，阻斷性GL50分子單抗對活化T細胞增殖具有顯著抑制作用。提示GL50分子與T細胞表面的受體相互作用后可產(chǎn)生共刺激信號，并參與免疫應答的啟動和調(diào)控?？赡軝C制:①表達GL50分子的活化T細胞可能臨時擔當抗原遞呈細胞的角色，和附近其他T細胞相互作用，導致后者活化、增殖、細胞因子分泌，進而形成效應性T細胞，即表達于活化T細胞表面的GL50分子在免疫應答放大效應中具有重要作用。②活化T細胞表面表達的GL50分子也可能與T細胞表面的自身受體結(jié)合，從而引起活化T細胞效應信號的自我放大。至于GL50分子在活化T細胞表面是如何參與免疫應答的精確性調(diào)節(jié)及相關(guān)調(diào)控機制，值得進一步探討。

綜上所述，GL50分子在活化T細胞表面呈誘導性表達，且可與T細胞表面自身受體結(jié)合在免疫應答放大效應中發(fā)揮重要作用。

［1］Dong H，Zhu G，Tamada K，et al.B7-H1，a third member of the B7 family，co-stimulates T cell proliferation and interleukin-10 secretion［J］.Nat Med，1999，5(12):1365-1369.

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