華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 方 樂 葛向陽*

浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)與微生物研究所 湯江武 姚曉紅 吳逸飛 孫 宏

傳統(tǒng)營養(yǎng)理論認(rèn)為，蛋白質(zhì)必須被消化成游離氨基酸之后才可被消化道吸收利用，蛋白質(zhì)營養(yǎng)即是氨基酸營養(yǎng)。而新的研究表明，蛋白質(zhì)經(jīng)消化道酶降解成游離氨基酸和各種小肽后，小肽以完整的形式和游離氨基酸同時被動物直接吸收利用（陳培賽和薛成君，2008；Backwell，1997b）。小肽是指由多個氨基酸殘基組成的具有多種生物功能的肽（崔艷紅，2009）。小肽在動物機(jī)體內(nèi)的作用主要有傳遞神經(jīng)息、促進(jìn)胃腸道消化功能、強(qiáng)化養(yǎng)分與吸收、調(diào)控物質(zhì)代謝、參與機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)等（Boze，2000；Backwell，1997a）。豆粕是一種優(yōu)質(zhì)的飼用蛋白原料，具有較高的蛋白質(zhì)含量，其氨基酸組成也較平衡，是一種潛在的優(yōu)質(zhì)小肽資源（Adetayo，2005）。傳統(tǒng)的豆粕發(fā)酵主要是利用微生物的作用降低豆粕中的抗?fàn)I養(yǎng)因子，或利用蛋白酶水解豆粕制備大豆肽，而采用微生物發(fā)酵和酶解協(xié)同作用處理豆粕，更有效地提高豆粕小肽化程度的報道較少（Lee，2005）。

本研究采用芽孢桿菌、酵母菌和中性蛋白酶混合處理豆粕，并優(yōu)化菌酶協(xié)同處理豆粕工藝，以期獲得小肽化程度更高的飼用肽，進(jìn)而提高豆粕的利用率與蛋白質(zhì)品質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料 豆粕：浙江紹興中大生物科技有限公司提供，去皮豆粕，粗蛋白質(zhì) ≥45%。

菌種：BSW-2為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），YT為釀酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae），均為本實(shí)驗(yàn)室保藏菌株。

中性蛋白酶：購于上海楷洋生物科技有限公司，酶活 ≥ 50U/g；酶活定義：在（40±0.2）℃，pH 7.0條件下，1 min內(nèi)水解酪蛋白底物，產(chǎn)生相當(dāng)于1 μg酚類化合物（由酪氨酸等同物表示）所需的酶量，定義為1個酶活單位，以U/g表示（DB33/T 459-2003）。

1.2 培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯（去皮）200 g、蔗糖（或葡萄糖）20 g、水 1000 mL、pH 值自然；

LB培養(yǎng)基：蛋白棟10 g、酵母粉5 g、氯化鈉10 g、水 1000 mL、pH 7.0。

1.3 方法

1.3.1 液體種子的制備 枯草芽孢桿菌經(jīng)斜面活化后刮取一環(huán)接入20 mL液體LB培養(yǎng)基，在30℃，160 r/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng)12 h，制成種子液；酵母菌經(jīng)斜面活化后刮取一環(huán)接入20 mL液體PDA培養(yǎng)基，在30℃，160 r/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng)18 h，制成種子液。

1.3.2 豆粕發(fā)酵方法 豆粕基礎(chǔ)菌酶協(xié)同處理?xiàng)l件為裝料量100 g/瓶、中性蛋白酶添加量400 U/g、BSW-2和YT接種量各1%、料水比1∶1、發(fā)酵溫度30℃、發(fā)酵時間48 h基礎(chǔ)上，豆粕以一定比例加水，接種，加酶，混合均勻后裝入罐頭瓶中，用8層紗布加報紙封口，放入培養(yǎng)箱中，設(shè)定溫度，在實(shí)驗(yàn)選取的時間取出，50℃烘干，粉碎，過80目篩待測。

1.3.3 豆粕菌酶混合發(fā)酵單因素試驗(yàn)

1.3.3.1 接種量對小肽含量的影響 在基礎(chǔ)發(fā)酵條件上，控制其他因素不變，分別接種0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%的 BSw-2和 YT混合菌液（比例為1∶1）進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束經(jīng)烘干、粉碎后測定小肽含量。

1.3.3.2 加酶量對小肽含量的影響 在基礎(chǔ)發(fā)酵條件上，控制其他因素不變，分別添加0、100、150、200、250、300、350、400、450、500 U/g 中性 蛋白酶進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束經(jīng)烘干、粉碎后測定小肽含量。

1.3.3.3 料水比對小肽含量的影響 在基礎(chǔ)發(fā)酵條件上，控制其他因素不變，分別按料水比1∶0.6、1∶0.8、1∶1、1∶1.2、1∶1.4、1∶1.6、1∶1.8 加水進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束經(jīng)烘干、粉碎后測定小肽含量。

1.3.3.4 處理溫度對小肽含量的影響 在基礎(chǔ)發(fā)酵條件上，控制其他因素不變，分別設(shè)定30、35、40、45、50℃的溫度進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束經(jīng)烘干、粉碎后測定小肽含量。

1.3.3.5 處理時間對小肽含量的影響 在基礎(chǔ)發(fā)酵條件上，控制其他因素不變，分別設(shè)定0、12、24、36、48、60、72 h 的時間進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束經(jīng)烘干、粉碎后測定小肽含量。

1.3.4 菌酶協(xié)同處理工藝優(yōu)化 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)5因素4水平L16（45）的正交試驗(yàn)進(jìn)行發(fā)酵工藝優(yōu)化。發(fā)酵結(jié)束經(jīng)烘干、粉碎后測定小肽、粗蛋白質(zhì)含量和進(jìn)行聚丙烯酰胺變性凝膠電泳（SDS-PAGE）。

1.3.5 發(fā)酵樣品小肽含量的測定 將待測樣品過80目篩，等體積加入10%三氯乙酸（TCA），在160 r/min搖床中30 min，然后4000 r/min離心15 min，取上清液做適當(dāng)稀釋后用改良Lowry法測定蛋白質(zhì)總量（張康，2001；GB/T 22492-2008）。

1.3.6 發(fā)酵樣品粗蛋白質(zhì)含量的測定 采用凱氏定氮法，參照GB/T 14771食品中蛋白質(zhì)的測定方法（GB/T 14771）。

1.3.7 發(fā)酵樣品蛋白質(zhì)降解度的檢測 發(fā)酵樣品蛋白質(zhì)降解度的檢測采用聚丙烯酰胺變性凝膠電泳法，（SDS-PAGE），具體方法見參考文獻(xiàn)（高麗和張聲華，2009；歐陽亮，2008）。

2 結(jié)果與分析

2.1 豆粕菌酶混合發(fā)酵工藝的研究

2.1.1 接種量對小肽含量的影響 由圖1結(jié)果可知：小肽含量隨著接種量的增加，說明BSW-2+YT發(fā)酵可以使小肽含量得到提高。當(dāng)接種量為2.5%時，豆粕發(fā)酵后小肽含量最高，為185.16 mg/g。

圖1 不同接種量對小肽含量的影響

2.1.2 加酶量對小肽含量的影響 由圖2結(jié)果可知，隨著加酶量的增加，小肽含量也呈增加趨勢，當(dāng)加酶量為400 U/g時，小肽含量最高，為192.89 mg/g。

圖2 不同加酶量對小肽含量的影響

2.1.3 料水比對小肽含量的影響 料水比是影響固體發(fā)酵的重要因素之一。水分含量影響發(fā)酵過程中微生物的生長，同時對酶的作用影響也比較大。由圖3的結(jié)果可知，小肽的含量隨著料水比的增加，呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，當(dāng)料水比為1∶1.2時，小肽含量最高，為194.90 mg/g。當(dāng)料水比過大時，小肽含量呈現(xiàn)減少的趨勢，可能是由于芽孢桿菌這類好氧菌在水分過多時生長受到抑制，從而影響了蛋白質(zhì)降解成小肽。

圖3 不同料水比對小肽含量的影響

2.1.4 發(fā)酵溫度對小肽含量的影響 溫度是影響酶活的重要因素，酶活的高低，直接影響到豆粕中蛋白質(zhì)酶解成小肽。由圖4的結(jié)果可知，小肽含量隨溫度的升高，先增加后減少。當(dāng)發(fā)酵溫度為40℃時，小肽含量最高，為192.73 mg/g。

圖4 不同發(fā)酵溫度對小肽含量的影響

2.1.5 發(fā)酵時間對小肽含量的影響 由圖5的結(jié)果可知：隨著發(fā)酵時間的延長，小肽的含量先上升后略有下降。當(dāng)發(fā)酵時間為48 h時，小肽含量最高為182.43 mg/g。當(dāng)發(fā)酵時間長于48 h，隨著酶解時間的延長，小肽被進(jìn)一步酶解生成游離氨基酸，含量反而出現(xiàn)下降趨勢，因此酶解時間不宜過長。

圖5 不同發(fā)酵時間對小肽含量的影響

2.2 豆粕菌酶混合發(fā)酵工藝優(yōu)化 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，得到各因素的適宜水平后，設(shè)計(jì)5因素4水平L16（45）的正交試驗(yàn)進(jìn)行發(fā)酵工藝優(yōu)化，試驗(yàn)因素水平編碼表、試驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)施方案和結(jié)果見表1、表 2。

2.2.1 正交試驗(yàn)結(jié)果的直觀分析 從表2直觀分析可以看出，極差列中接種量因素的極差值最大，所以得出結(jié)論接種量因素對小肽含量的影響最大，其次是發(fā)酵溫度、料水比、發(fā)酵時間、發(fā)加酶量。

發(fā)酵最優(yōu)條件為A1B3C2D4E3，即接種量1.5%，加酶量 450 U/g，料水比 1∶1.4，溫度 40 ℃，時間60 h。

2.2.2 發(fā)酵方案的確定 從正交表中觀察得知最優(yōu)組合為A1B3C3D3E3，與理論最優(yōu)條件A1B3C2D4E3對比可知發(fā)酵時間不同，結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，發(fā)酵時間過長小肽含量反而有所下降，因此對這兩種方案進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，測得小肽含量與粗蛋白質(zhì)含量見表3。

表1 試驗(yàn)因素編碼表

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)施方案和結(jié)果

由表3可知，理論最優(yōu)條件沒有正交表中最優(yōu)組合結(jié)果好，因此最優(yōu)條件為A1B3C3D3E3，即接種量 1.5%，加酶量 450 U/g，料水比 1∶1.4，溫度40℃，時間48 h，發(fā)酵結(jié)束后小肽含量從11.40 mg/g提高到199.65 mg/g；粗蛋白質(zhì)從47.62%提高到56.72%。

表3 正交試驗(yàn)驗(yàn)正試驗(yàn)結(jié)果

2.3 SDS-PAGE電泳檢測蛋白降解程度 將最終確定的發(fā)酵工藝的發(fā)酵產(chǎn)品進(jìn)行SDS-PAGE檢測，以原料豆粕做對照，結(jié)果見圖6。

圖6結(jié)果顯示，與原豆粕相比，發(fā)酵產(chǎn)品中的大分子蛋白得到有效降解，生成小分子的多肽、小肽和氨基酸，其蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量在45 kDa以下，小于14.4 kDa的占很大一部份，由此可見，發(fā)酵后豆粕的品質(zhì)得到了有效提升。

圖6 發(fā)酵豆粕SDS-PAGE圖

3 討論

小肽的制備主要采用微生物發(fā)酵法和酶解法。從本質(zhì)上講，微生物發(fā)酵法和酶解法都是利用蛋白酶的酶解作用（Jung，2006；李書國，2000）。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)小肽的工藝主要有固體發(fā)酵和液體發(fā)酵。微生物固體發(fā)酵的優(yōu)點(diǎn)是能較好地去除豆粕中的抗?fàn)I養(yǎng)因子，發(fā)酵過程中加入的微生物如乳酸菌、酵母菌、芽孢桿菌等，其本身就是益生菌，有利于改善動物胃腸道的微生態(tài)環(huán)境，減少抗生素的應(yīng)用和疾病的發(fā)生（吳勝華和李呂木，2008；周伏忠，2007）。本研究采用的是芽孢桿菌和酵母菌混合發(fā)酵豆粕，芽孢桿菌相對于霉菌來講，生長速度較快，發(fā)酵周期較短，降低了生產(chǎn)成本。并且在發(fā)酵過程中分泌蛋白酶，利用蛋白酶的內(nèi)切作用將蛋白質(zhì)降解成低分子質(zhì)量的肽，因此對豆粕蛋白有較好的降解作用；酵母菌在發(fā)酵過程中產(chǎn)生酒香味，使發(fā)酵產(chǎn)品的風(fēng)味有所提升，同時酵母本身也是很好的菌體蛋白，使豆粕發(fā)酵后的粗蛋白質(zhì)提高。

目前酶解法制備小肽，主要采用中性蛋白酶、堿性蛋白酶和酸性蛋白酶（劉通訊，2002）。萬琦（2003），劉大川和鐘方旭（1996）研究了 5 種蛋白酶：中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶的特性，篩選出堿性蛋白酶水解大豆蛋白制大豆肽，水解效果雖然較好，但是產(chǎn)物帶有強(qiáng)烈的苦味，需要采取一定的脫苦工藝后方可使用。王之盛和況應(yīng)谷（2004）的研究結(jié)果表明，在堿性條件下有利于豆粕抗原蛋白的降解，中堿性條件有利于7S和2S小分子質(zhì)量抗原蛋白的進(jìn)一步降解。本研究采用中性蛋白酶酶解豆粕，相對于堿性蛋白酶和酸性蛋白酶，避免固體發(fā)酵pH調(diào)節(jié)困難的問題，使發(fā)酵方式更為簡單有效。

菌酶混合協(xié)同處理法生產(chǎn)小肽，充分利用微生物發(fā)酵與酶解各自的優(yōu)勢，發(fā)揮微生物與蛋白酶的協(xié)同作用使豆粕蛋白降解更充分，小肽化程度更高，同時避免了酶解產(chǎn)品的苦味，提高產(chǎn)品風(fēng)味及適口性，進(jìn)一步改善了豆粕飼用肽產(chǎn)品品質(zhì)和營養(yǎng)價值，這對實(shí)現(xiàn)飼用肽的工業(yè)化生產(chǎn)具有重要的參考價值。

4 結(jié)論

以豆粕為原料，利用芽孢桿菌、酵母菌、中性蛋白酶混合發(fā)酵豆粕生產(chǎn)小肽飼料，在接種量1.5%、加酶量 450 U/g、料水比 1∶1.4、發(fā)酵溫度40℃、發(fā)酵時間48 h條件下，豆粕發(fā)酵后，小肽含量和粗蛋白含質(zhì)量都有顯著提高，小肽含量從11.40 mg/g提高到 199.65 mg/g；粗蛋白質(zhì)從47.62提高到56.72%。

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