農(nóng)業(yè)部飼料質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心（成都） 李 云 趙立軍 張 靜

氯烯雌醚為一種非甾體雌激素類藥，能調(diào)節(jié)垂體前葉釋放促性腺激素，通過減少下丘腦促黃體生成素釋放因子的釋放，降低促卵泡激素（FSH）、促黃體生成激素（LH）從垂體的釋放。氯烯雌醚貯藏于脂肪組織內(nèi)，并緩慢釋放，較易在動(dòng)物體內(nèi)殘留。若食用含有氯烯雌醚殘留的肉食品后會(huì)擾亂人體激素平衡。由于氯烯雌醚能夠通過蛋白質(zhì)同化作用提高食欲、促進(jìn)畜禽生長(zhǎng)，有可能被添加到飼料中用來提高飼料轉(zhuǎn)化率。

我國(guó)已明令禁止在飼料中添加氯烯雌醚，因此有必要制定其定量檢測(cè)方法。目前藥物中氯烯雌醚的測(cè)定方法有滴定法、高效液相色譜法等，但有關(guān)飼料中氯烯雌醚的測(cè)定方法鮮見報(bào)道。本文建立了飼料中氯烯雌醚的提取、凈化和測(cè)定方法。該方法方便實(shí)用、準(zhǔn)確可靠。

1 材料與儀器

1.1 試劑與材料 除非另有規(guī)定，僅使用分析純?cè)噭┖头螱B/T6682的三級(jí)水，色譜分析用水符合GB/T6682一級(jí)水的規(guī)定。甲醇：色譜純；乙腈：色譜純；氨水：濃度25%～28%；C18固相萃取柱：200 mg/3 mL；濾膜：0.45 μm，有機(jī)相；流動(dòng)相∶甲醇∶水=82∶18（V∶V）；氯烯雌醚標(biāo)準(zhǔn)品（純度 ＞95%）。

氯烯雌醚標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置：（1）標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：稱取10.0 mg（精確到0.1 mg）的氯烯雌醚標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解并定容于100 mL容量瓶中，該溶液濃度為100 μg/mL，于4℃冰箱內(nèi)貯存，有效期1個(gè)月。（2）標(biāo)準(zhǔn)工作液：用移液管分別準(zhǔn)確移取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用甲醇配制標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：0.05 μg/mL，1.0 μg/mL，2.0 μg/mL，5.0 μg/mL，10.0 μg/mL，20.0 μg/mL，50.0 μg/mL?，F(xiàn)配現(xiàn)用。 淋洗液：25%氨水∶水=5∶95（V∶V）。

1.2 儀器與設(shè)備 高效液相色譜儀，配有二極管陣列檢測(cè)器或紫外檢測(cè)器；離心機(jī)：5000 r/min以上；渦旋混合器；超聲波清洗器；氮吹儀，可控溫至50℃；固相萃取裝置；高速勻質(zhì)器；振蕩器；帶蓋塑料離心管：50 mL。

2 方法與結(jié)果

2.1 液相色譜條件 色譜柱：C18柱（4.6 mm×250 mm，粒度5 μm）或性能相當(dāng)?shù)纳V柱；柱溫30 ℃；流動(dòng)相流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：307 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 試樣的提取與凈化

2.2.1 提取 準(zhǔn)確稱取配合飼料5 g、濃縮飼料或添加劑預(yù)混合飼料稱取2 g（精確到0.01 g），置于50 mL離心管中，加入提取液乙腈10.0 mL，渦旋振蕩2 min。然后將離心管置于振蕩器上振蕩20 min，然后在離心機(jī)上以5000 r/min離心5 min，吸取上清液于另一具塞試管中，待凈化。

2.2.2 凈化 每一試樣各準(zhǔn)備一只C18小柱，依次用3 mL甲醇、3 mL蒸餾水、3 mL甲醇活化。將上述提取液3.0 mL與等體積的蒸餾水混合均勻后，吸取5.0 mL過此小柱（流速＜1.0 mL/min）。用6 mL淋洗液淋洗,最后用3 mL甲醇洗脫，收集洗脫液于10 mL試管內(nèi)，洗脫液于50℃下用氮?dú)獯蹈?，殘余物?.0 mL甲醇定容，渦旋混合1 min，過0.45 μm濾膜作為試樣制備液，供高效液相色譜測(cè)定。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 在選定的色譜條件下，將分別配制為 0.05、0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，將不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液分別進(jìn)樣20 μL做定量校正曲線。以進(jìn)樣濃度x（μg/mL）為橫坐標(biāo)，以峰面積y為縱坐標(biāo)，做標(biāo)準(zhǔn)曲線（結(jié)果見表1）。結(jié)果表明，氯烯雌醚標(biāo)準(zhǔn)工作液在0.05～50.0 μg/mL濃度范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

回歸方程：y=50.596x－8.463（R=0.9996）。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

2.4 檢測(cè)限和檢出限 在本試驗(yàn)條件下，將氯烯雌醚標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)稀釋后加入到空白飼料中經(jīng)提取測(cè)定，根據(jù)信噪比（S/N）=3的峰響應(yīng)值和樣品前處理的稀釋倍數(shù)，得出方法的檢測(cè)限為0.1 mg/kg。同樣的添加適量標(biāo)準(zhǔn)溶液至空白飼料，經(jīng)提取測(cè)定，依據(jù)信噪比（S/N）=10測(cè)得方法的定量限為0.3 mg/kg。

2.5 回收率實(shí)驗(yàn)及精密度 為了考查方法及儀器的準(zhǔn)確度，對(duì)豬飼料﹑禽飼料﹑魚飼料樣品進(jìn)行了回收率實(shí)驗(yàn)，每個(gè)水平平行測(cè)定5次，回收率多數(shù)大于80.0%；相對(duì)偏差小于5.0%，變異系數(shù)小于7.0%。結(jié)果見表2﹑表3和表4。從表中可以看出，本方法在三種空白飼料中的平均回收率范圍為76.6%～107.0%，符合分析的要求。變異系數(shù)范圍在10%以下，表明方法符合痕量分析的精密度要求。

表2 豬飼料回收率實(shí)驗(yàn)及精密度

表3 禽飼料回收率實(shí)驗(yàn)及精密度

表4 魚飼料回收率實(shí)驗(yàn)及精密度

3 討論

3.1 提取條件的選擇 氯烯雌醚可以用甲醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯等有機(jī)溶劑提取，結(jié)果表明，甲醇、乙腈、丙酮三種溶劑提取效率相當(dāng),乙酸乙酯提取效率較低。但乙腈比甲醇、丙酮所提取得到的干擾雜質(zhì)要少，因此選用乙腈作為提取溶劑。

對(duì)乙腈的用量也進(jìn)行了比較，當(dāng)選用20 mL時(shí)，雖然對(duì)高添加濃度的回收率較好，但此時(shí)配合飼料添加較低濃度（0.5 mg/kg）儀器響應(yīng)不明顯，經(jīng)過優(yōu)化將提取溶劑選擇在10 mL，減少對(duì)待測(cè)物質(zhì)的稀釋。此外，當(dāng)預(yù)混合飼料中添加氯烯雌醚的量超過200.0 mg/kg時(shí)，固相萃取柱吸附可能過載，致使回收率開始下降，因此需將提取液稀釋后再進(jìn)行凈化。

3.2 凈化條件的選擇 本方法采用C18固相萃取柱。通過向提取液中加入等倍的水來調(diào)節(jié)提取液的溶液強(qiáng)度，進(jìn)而使待測(cè)物質(zhì)有效地吸附在固相萃取柱上，用氨水淋洗水溶性雜質(zhì)，從而達(dá)到分離凈化的目的。經(jīng)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化用5%的氨水溶液能更好的除去雜質(zhì)，其結(jié)果并不影響回收率。本實(shí)驗(yàn)還做了甲醇、乙腈和丙酮三種溶劑的洗脫效果進(jìn)行了比較，這三種溶劑均能定量洗脫被測(cè)物，因?yàn)樯V流動(dòng)相采用甲醇，所以本方法采用甲醇為洗脫劑，得到的色譜峰對(duì)稱性更好。甲醇的用量對(duì)回收率有影響，用量太少，洗脫不完全，用量太多，洗脫時(shí)間長(zhǎng)，本方法選用3 mL甲醇為洗脫試劑，效果最好，標(biāo)準(zhǔn)品過柱率可達(dá)96.2%。

3.3 色譜檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 已報(bào)道的氯烯雌醚測(cè)定方法中波長(zhǎng)均為247 nm。本實(shí)驗(yàn)用紫外分光光度計(jì)對(duì)氯烯雌醚的紫外吸收光譜進(jìn)行了測(cè)定。在200～400 nm之間，氯烯雌醚的紫外最大吸收波長(zhǎng)分別位于247 nm處與307 nm處，如下圖1所示。

圖1 氯烯雌醚紫外吸收光譜圖

當(dāng)實(shí)驗(yàn)選擇247 nm為分析波長(zhǎng)時(shí)，雖然此時(shí)氯烯雌醚有最大的紫外吸收，檢測(cè)靈敏度很高，但是由于飼料基質(zhì)復(fù)雜，多數(shù)雜質(zhì)在247 nm附近也存在強(qiáng)烈的紫外吸收，進(jìn)而對(duì)氯烯雌醚的測(cè)定造成嚴(yán)重的干擾，較低含量的氯烯雌醚在測(cè)定時(shí)被雜質(zhì)所掩蓋，分離度大大降低，極大地影響了實(shí)驗(yàn)測(cè)定的檢測(cè)限。當(dāng)實(shí)驗(yàn)選擇307 nm為分析波長(zhǎng)時(shí)，盡管氯烯雌醚在此時(shí)的紫外吸收不是最強(qiáng)，但此時(shí)飼料中多數(shù)雜質(zhì)在此處沒有紫外吸收且飼料中常見藥物添加劑未見干擾。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇307 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立的飼料中氯烯雌醚的測(cè)定方法具有較高的靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度，且回收率較高。樣品的提取和凈化方法操作簡(jiǎn)單，易于掌握，適用于飼料中違禁藥物氯烯雌醚的檢測(cè)。