農(nóng)業(yè)部飼料質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心(成都) 李 云 趙立軍 張 靜
氯烯雌醚為一種非甾體雌激素類藥,能調(diào)節(jié)垂體前葉釋放促性腺激素,通過減少下丘腦促黃體生成素釋放因子的釋放,降低促卵泡激素(FSH)、促黃體生成激素(LH)從垂體的釋放。氯烯雌醚貯藏于脂肪組織內(nèi),并緩慢釋放,較易在動(dòng)物體內(nèi)殘留。若食用含有氯烯雌醚殘留的肉食品后會(huì)擾亂人體激素平衡。由于氯烯雌醚能夠通過蛋白質(zhì)同化作用提高食欲、促進(jìn)畜禽生長(zhǎng),有可能被添加到飼料中用來提高飼料轉(zhuǎn)化率。
我國(guó)已明令禁止在飼料中添加氯烯雌醚,因此有必要制定其定量檢測(cè)方法。目前藥物中氯烯雌醚的測(cè)定方法有滴定法、高效液相色譜法等,但有關(guān)飼料中氯烯雌醚的測(cè)定方法鮮見報(bào)道。本文建立了飼料中氯烯雌醚的提取、凈化和測(cè)定方法。該方法方便實(shí)用、準(zhǔn)確可靠。
1.1 試劑與材料 除非另有規(guī)定,僅使用分析純?cè)噭┖头螱B/T6682的三級(jí)水,色譜分析用水符合GB/T6682一級(jí)水的規(guī)定。甲醇:色譜純;乙腈:色譜純;氨水:濃度25%~28%;C18固相萃取柱:200 mg/3 mL;濾膜:0.45 μm,有機(jī)相;流動(dòng)相∶甲醇∶水=82∶18(V∶V);氯烯雌醚標(biāo)準(zhǔn)品(純度 >95%)。
氯烯雌醚標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置:(1)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液:稱取10.0 mg(精確到0.1 mg)的氯烯雌醚標(biāo)準(zhǔn)品,用甲醇溶解并定容于100 mL容量瓶中,該溶液濃度為100 μg/mL,于4℃冰箱內(nèi)貯存,有效期1個(gè)月。(2)標(biāo)準(zhǔn)工作液:用移液管分別準(zhǔn)確移取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用甲醇配制標(biāo)準(zhǔn)工作溶液:0.05 μg/mL,1.0 μg/mL,2.0 μg/mL,5.0 μg/mL,10.0 μg/mL,20.0 μg/mL,50.0 μg/mL?,F(xiàn)配現(xiàn)用。 淋洗液:25%氨水∶水=5∶95(V∶V)。
1.2 儀器與設(shè)備 高效液相色譜儀,配有二極管陣列檢測(cè)器或紫外檢測(cè)器;離心機(jī):5000 r/min以上;渦旋混合器;超聲波清洗器;氮吹儀,可控溫至50℃;固相萃取裝置;高速勻質(zhì)器;振蕩器;帶蓋塑料離心管:50 mL。
2.1 液相色譜條件 色譜柱:C18柱(4.6 mm×250 mm,粒度5 μm)或性能相當(dāng)?shù)纳V柱;柱溫30 ℃;流動(dòng)相流速:1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):307 nm;進(jìn)樣量:20 μL。
2.2 試樣的提取與凈化
2.2.1 提取 準(zhǔn)確稱取配合飼料5 g、濃縮飼料或添加劑預(yù)混合飼料稱取2 g(精確到0.01 g),置于50 mL離心管中,加入提取液乙腈10.0 mL,渦旋振蕩2 min。然后將離心管置于振蕩器上振蕩20 min,然后在離心機(jī)上以5000 r/min離心5 min,吸取上清液于另一具塞試管中,待凈化。
2.2.2 凈化 每一試樣各準(zhǔn)備一只C18小柱,依次用3 mL甲醇、3 mL蒸餾水、3 mL甲醇活化。將上述提取液3.0 mL與等體積的蒸餾水混合均勻后,吸取5.0 mL過此小柱(流速<1.0 mL/min)。用6 mL淋洗液淋洗,最后用3 mL甲醇洗脫,收集洗脫液于10 mL試管內(nèi),洗脫液于50℃下用氮?dú)獯蹈?,殘余物?.0 mL甲醇定容,渦旋混合1 min,過0.45 μm濾膜作為試樣制備液,供高效液相色譜測(cè)定。
2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 在選定的色譜條件下,將分別配制為 0.05、0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液,將不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液分別進(jìn)樣20 μL做定量校正曲線。以進(jìn)樣濃度x(μg/mL)為橫坐標(biāo),以峰面積y為縱坐標(biāo),做標(biāo)準(zhǔn)曲線(結(jié)果見表1)。結(jié)果表明,氯烯雌醚標(biāo)準(zhǔn)工作液在0.05~50.0 μg/mL濃度范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。
回歸方程:y=50.596x-8.463(R=0.9996)。
表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制
2.4 檢測(cè)限和檢出限 在本試驗(yàn)條件下,將氯烯雌醚標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)稀釋后加入到空白飼料中經(jīng)提取測(cè)定,根據(jù)信噪比(S/N)=3的峰響應(yīng)值和樣品前處理的稀釋倍數(shù),得出方法的檢測(cè)限為0.1 mg/kg。同樣的添加適量標(biāo)準(zhǔn)溶液至空白飼料,經(jīng)提取測(cè)定,依據(jù)信噪比(S/N)=10測(cè)得方法的定量限為0.3 mg/kg。
2.5 回收率實(shí)驗(yàn)及精密度 為了考查方法及儀器的準(zhǔn)確度,對(duì)豬飼料﹑禽飼料﹑魚飼料樣品進(jìn)行了回收率實(shí)驗(yàn),每個(gè)水平平行測(cè)定5次,回收率多數(shù)大于80.0%;相對(duì)偏差小于5.0%,變異系數(shù)小于7.0%。結(jié)果見表2﹑表3和表4。從表中可以看出,本方法在三種空白飼料中的平均回收率范圍為76.6%~107.0%,符合分析的要求。變異系數(shù)范圍在10%以下,表明方法符合痕量分析的精密度要求。
表2 豬飼料回收率實(shí)驗(yàn)及精密度
表3 禽飼料回收率實(shí)驗(yàn)及精密度
表4 魚飼料回收率實(shí)驗(yàn)及精密度
3.1 提取條件的選擇 氯烯雌醚可以用甲醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯等有機(jī)溶劑提取,結(jié)果表明,甲醇、乙腈、丙酮三種溶劑提取效率相當(dāng),乙酸乙酯提取效率較低。但乙腈比甲醇、丙酮所提取得到的干擾雜質(zhì)要少,因此選用乙腈作為提取溶劑。
對(duì)乙腈的用量也進(jìn)行了比較,當(dāng)選用20 mL時(shí),雖然對(duì)高添加濃度的回收率較好,但此時(shí)配合飼料添加較低濃度(0.5 mg/kg)儀器響應(yīng)不明顯,經(jīng)過優(yōu)化將提取溶劑選擇在10 mL,減少對(duì)待測(cè)物質(zhì)的稀釋。此外,當(dāng)預(yù)混合飼料中添加氯烯雌醚的量超過200.0 mg/kg時(shí),固相萃取柱吸附可能過載,致使回收率開始下降,因此需將提取液稀釋后再進(jìn)行凈化。
3.2 凈化條件的選擇 本方法采用C18固相萃取柱。通過向提取液中加入等倍的水來調(diào)節(jié)提取液的溶液強(qiáng)度,進(jìn)而使待測(cè)物質(zhì)有效地吸附在固相萃取柱上,用氨水淋洗水溶性雜質(zhì),從而達(dá)到分離凈化的目的。經(jīng)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化用5%的氨水溶液能更好的除去雜質(zhì),其結(jié)果并不影響回收率。本實(shí)驗(yàn)還做了甲醇、乙腈和丙酮三種溶劑的洗脫效果進(jìn)行了比較,這三種溶劑均能定量洗脫被測(cè)物,因?yàn)樯V流動(dòng)相采用甲醇,所以本方法采用甲醇為洗脫劑,得到的色譜峰對(duì)稱性更好。甲醇的用量對(duì)回收率有影響,用量太少,洗脫不完全,用量太多,洗脫時(shí)間長(zhǎng),本方法選用3 mL甲醇為洗脫試劑,效果最好,標(biāo)準(zhǔn)品過柱率可達(dá)96.2%。
3.3 色譜檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 已報(bào)道的氯烯雌醚測(cè)定方法中波長(zhǎng)均為247 nm。本實(shí)驗(yàn)用紫外分光光度計(jì)對(duì)氯烯雌醚的紫外吸收光譜進(jìn)行了測(cè)定。在200~400 nm之間,氯烯雌醚的紫外最大吸收波長(zhǎng)分別位于247 nm處與307 nm處,如下圖1所示。
圖1 氯烯雌醚紫外吸收光譜圖
當(dāng)實(shí)驗(yàn)選擇247 nm為分析波長(zhǎng)時(shí),雖然此時(shí)氯烯雌醚有最大的紫外吸收,檢測(cè)靈敏度很高,但是由于飼料基質(zhì)復(fù)雜,多數(shù)雜質(zhì)在247 nm附近也存在強(qiáng)烈的紫外吸收,進(jìn)而對(duì)氯烯雌醚的測(cè)定造成嚴(yán)重的干擾,較低含量的氯烯雌醚在測(cè)定時(shí)被雜質(zhì)所掩蓋,分離度大大降低,極大地影響了實(shí)驗(yàn)測(cè)定的檢測(cè)限。當(dāng)實(shí)驗(yàn)選擇307 nm為分析波長(zhǎng)時(shí),盡管氯烯雌醚在此時(shí)的紫外吸收不是最強(qiáng),但此時(shí)飼料中多數(shù)雜質(zhì)在此處沒有紫外吸收且飼料中常見藥物添加劑未見干擾。因此,本實(shí)驗(yàn)選擇307 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)。
本實(shí)驗(yàn)建立的飼料中氯烯雌醚的測(cè)定方法具有較高的靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度,且回收率較高。樣品的提取和凈化方法操作簡(jiǎn)單,易于掌握,適用于飼料中違禁藥物氯烯雌醚的檢測(cè)。