李新芝，張治平，司軍強(qiáng)，張忠雙，李 靜，石文艷，馬克濤△

(1.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院新疆地方與民族高發(fā)病省部共建重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-電生理研究室，2.第一附屬醫(yī)院耳鼻喉科，石河子 832002)

血管微動(dòng)脈病變主要導(dǎo)致血管的舒縮功能障礙，而微動(dòng)脈細(xì)胞靜息膜電位(resting membrane potential，RP)在血管舒縮調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，管腔壓力為零的離體微動(dòng)脈細(xì)胞RP在-60～-75 mV之間[1]。管腔壓力為60mmHg或在體[2]情況下微動(dòng)脈細(xì)胞RP為-40mV。不同部位微動(dòng)脈間的差異較大，有報(bào)道稱遠(yuǎn)端大腦微動(dòng)脈的靜息膜電位要遠(yuǎn)高于近端大腦微動(dòng)脈[3]。此外我們前期在離體豚鼠耳蝸螺旋動(dòng)脈上發(fā)現(xiàn)細(xì)胞RP呈獨(dú)特的雙峰分布，52%細(xì)胞RP平均在-74 mV，48%細(xì)胞RP平均在-41 mV，高K+和神經(jīng)遞質(zhì)ACh在高、低RP細(xì)胞上的反應(yīng)形式和離子機(jī)制都截然不同[4，5]。本研究是以急性分離的豚鼠冠狀動(dòng)脈微動(dòng)脈(coronary arteriole，CA)為研究對(duì)象，應(yīng)用細(xì)胞內(nèi)微電極技術(shù)記錄微動(dòng)脈細(xì)胞RP，分析維持RP的離子機(jī)制，為我們更好的了解CA細(xì)胞的電生理特性提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及標(biāo)本制備

實(shí)驗(yàn)所用豚鼠雌雄不拘(新疆自治區(qū)疾病控制中心動(dòng)物飼養(yǎng)科提供，動(dòng)物質(zhì)量符合一級(jí)標(biāo)準(zhǔn))，重約250～500g。肌注的混合麻醉藥物是氯胺酮500mg、甲苯噻嗪20mg和乙酰丙嗪10mg溶于8.5 ml蒸餾水中，配制成混合麻醉藥物，按1 ml/kg臀部肌肉注射，動(dòng)物在麻醉狀態(tài)下放血處死，迅速取出心臟，并置于含有95%O2和5%CO2的 37℃飽和生理鹽溶液(Krebs)中。Krebs液成分是(mmol/L):NaCl 125 ，KCl 5 ，CaCl21.6 ，MgCl21.2 ，NaH2PO41.2 ，NaHCO320，葡萄糖 8.3，將pH 調(diào)至 7.4。在Krebs液中，迅速取出冠狀動(dòng)脈相連的輻射狀微小動(dòng)脈，置于Krebs液中孵育30min后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 細(xì)胞內(nèi)微電極記錄

孵育后的標(biāo)本轉(zhuǎn)移到記錄用實(shí)驗(yàn)灌流槽中，血管段長約2～5 mm，直徑約為40～80μm。在顯微鏡下清除與CA相連的結(jié)締組織，再用很細(xì)小的鋼針將CA固定在灌流槽底部的硅膠上。連續(xù)用37℃的生理鹽溶液灌流30min之后可持續(xù)進(jìn)行電生理實(shí)驗(yàn)6～8 h。微電極內(nèi)充灌2 mol/L KCl，阻抗為 60～150MΩ。細(xì)胞內(nèi)穿刺是通過微操縱推進(jìn)器推動(dòng)玻璃微電極刺向血管外表面進(jìn)行盲插，同時(shí)通過NPI前置放大器監(jiān)測(cè)跨膜電位和注射電流，生物電信號(hào)通過PC計(jì)算機(jī)記錄。采樣間隔為0.1、0.5或10ms。成功刺入細(xì)胞穩(wěn)定5 min后并參照退出電極后的電位水平為細(xì)胞RP大小。

1.3 實(shí)驗(yàn)所用藥物

所用藥物用Krebs液配制，通過開關(guān)控制藥物灌流標(biāo)本，保持灌流速度、溫度和其它成分不變。所用藥物ACh由Sigma Research Biochemicals Inc.提供。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，顯著性采用 t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 CA細(xì)胞RP獨(dú)特的雙峰分布

實(shí)驗(yàn)中共成功記錄了112個(gè)細(xì)胞，RP范圍為-88～-26 mV，細(xì)胞平均RP為(-65±4.2)mV。應(yīng)用高斯函數(shù)擬合后細(xì)胞RP呈雙峰分布，兩個(gè)峰值分別為-43 mV和-74 mV，分別稱為高和低RP(圖1)。實(shí)驗(yàn)中我們觀察了10mmol/L K+和3μmol/L ACh對(duì)高、低RP細(xì)胞的作用。在低RP細(xì)胞，高K+和ACh引起去極化反應(yīng)(圖 2A)，10mmol/L K+和 3μmol/L ACh引起的去極化幅度分別為(9.6±1.2)mV(n=23)和(8.7±0.69)mV(n=15)。在高 RP細(xì)胞，高K+和ACh引起超極化反應(yīng)(圖2B)，10mmol/L K+和3μmol/L ACh引起的超極化幅度分別為(-7.4±0.87)mV(n=13)和(-15±1.2)mV(n=16)。

Fig.1 Two-peak distribution of CA cell RP

Fig.2 Responses induced by high K+and ACh in high and low RP cells

2.2 Kir介導(dǎo)CA細(xì)胞RP的雙峰分布

實(shí)驗(yàn)中預(yù)灌流Kir阻斷劑Ba2+，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ba2+可以濃度依賴的去極化低RP細(xì)胞(圖 3A)，1、3、10、30、100、300、1000、3000μmol/L 的 Ba2+引起 CA 細(xì)胞去極化幅度分別為(0.45±0.27)mV(n=4)、(0.48±0.24)mV(n=4)、(3.6±0.82)mV(n=7)、(6.7±0.96)mV(n=10)、(16±1.5)mV(n=11)、(37±3.7)mV(n=11)、(36±3.2)mV(n=7)、(45±2.4)mV(n=7)，EC50是 120μmol/L(圖 3B)。應(yīng)用 ≥100μmol/L Ba2+后低RP細(xì)胞去極化到高RP水平，ACh介導(dǎo)反應(yīng)的形式也發(fā)生相應(yīng)改變，圖4顯示CA細(xì)胞初始為低 RP水平，3μmol/L ACh引起去極化反應(yīng) ，持續(xù)灌流 100μmol/L Ba2+阻斷 Kir后 ，細(xì)胞去極化到高RP水平，此時(shí)3μmol/L ACh引起超級(jí)化反應(yīng)。

Fig.3 Effect of Ba2+on RP of CA cells

Fig.4 Kirmediated conversion between high and low RP of CA

3 討論

微動(dòng)脈是小動(dòng)脈的末梢分支，直徑在5～100μm之間，和小動(dòng)脈共同決定了血管的外周阻力。目前已知微動(dòng)脈上表達(dá)的主要功能性K+通道包括鈣激活的 K+通道(Ca2+-activated K+channels，KCa)、ATP敏感的 K+通道(ATP-sensitive K+channels，KATP)、Kir和電壓依賴K+通道(voltage-gated K+channels，KV)[6]。其中Kir是維持微動(dòng)脈細(xì)胞RP的重要通道[7]。Kir通道主要表達(dá)在小直徑的微動(dòng)脈上。目前認(rèn)為Kir通道主要參與維持微動(dòng)脈細(xì)胞RP和血管緊張度調(diào)節(jié)[7]。Kir也被認(rèn)為是微動(dòng)脈自身調(diào)節(jié)的關(guān)鍵跨膜蛋白[3]，在腦動(dòng)脈、腎臟動(dòng)脈、提睪肌和冠狀動(dòng)脈基礎(chǔ)舒縮運(yùn)動(dòng)中，Kir通道發(fā)揮重要作用[8]。前期研究發(fā)現(xiàn)在離體豚鼠耳蝸螺旋動(dòng)脈上血管細(xì)胞RP獨(dú)特的雙峰分布由Kir通道的激活或失活介導(dǎo)[4，5]，本實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果與之一致。

ACh不僅是神經(jīng)遞質(zhì)，同時(shí)也是一種有效的血管舒張物質(zhì)，參與許多血管床的調(diào)節(jié)活動(dòng)。研究發(fā)現(xiàn)，在微動(dòng)脈上ACh可引起雙向反應(yīng)[5]，既引起細(xì)胞超極化反應(yīng)也可以引起去極化反應(yīng)。當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞功能完整時(shí)，ACh引起血管平滑肌細(xì)胞超極化并舒張血管，剝除內(nèi)皮細(xì)胞層后，ACh引起血管平滑肌細(xì)胞去極化反應(yīng)并收縮血管[9]。目前普遍認(rèn)為ACh引起細(xì)胞超極化反應(yīng)和舒張血管是由內(nèi)皮超極化因子或內(nèi)皮舒張因子介導(dǎo)。在豚鼠耳蝸螺旋動(dòng)脈上我們證實(shí)ACh通過激活內(nèi)皮細(xì)胞膜上的KCa通道，致使K+外流，引起內(nèi)皮細(xì)胞超極化反應(yīng)[11]。對(duì)于血管平滑肌細(xì)胞來說，ACh引起超極化反應(yīng)幅度的60%是由內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)內(nèi)皮細(xì)胞與平滑肌細(xì)胞之間的縫隙連接通道傳來，剩余的40%則是內(nèi)皮細(xì)胞釋放到細(xì)胞外的K+，導(dǎo)致[K+]o濃度升高，激活血管平滑肌細(xì)胞上的Kir和Na+-K+泵引起。另一方面，直到現(xiàn)在ACh引起去極化和收縮血管的機(jī)制仍不清楚。在豚鼠耳蝸螺旋動(dòng)脈上我們證實(shí)ACh通過激活非選擇性的陽離子通道和失活Kir通道引起細(xì)胞去極化反應(yīng)[10]。本實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)在CA細(xì)胞上ACh引起雙向反應(yīng)，既在高RP細(xì)胞上引起超極化反應(yīng)，而在低RP細(xì)胞上引起去極化反應(yīng)。在后期的工作中ACh在CA上引起去極化和超極化的離子機(jī)制將是我們重點(diǎn)研究內(nèi)容。

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