周 杰，趙茹茜，陳 杰，陳永秦

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，合肥 230036;2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部動物生理生化重點開放實驗室，江蘇 南京 210095;3.上海華擴(kuò)達(dá)生化科技有限公司，上海 201206)

自20世紀(jì)80年代末以來，利用脂肪細(xì)胞膜(adipocyte plasma membeane，APM)免疫技術(shù)在調(diào)節(jié)動物生長和提高動物胴體瘦肉率方面取得了很大的進(jìn)展，經(jīng)脂肪細(xì)胞膜免疫的動物，不僅脂肪沉積減少，瘦肉量增加[1，2]。目前，主要通過被動免疫的方式處理動物，所用抗體通常來自抗血清，通過皮下或腹膜注射處理動物，這樣會引起動物短時間內(nèi)的應(yīng)激反應(yīng)，且在生產(chǎn)上的應(yīng)用也受到限制。卵黃抗體因其特有的理化性質(zhì)，對消化酶具有較強的抵抗能力，因而可供口服(鐘青萍等，1998)。但口服脂肪細(xì)胞膜蛋白卵黃抗體對哺乳動物脂肪沉積的影響尚未見報道。本試驗以大鼠為動物模型，在制備豬脂肪細(xì)胞膜蛋白卵黃抗體的基礎(chǔ)上采用口服方式被動免疫大鼠，并與皮下注射方式進(jìn)行比較，通過測定大鼠生長性能、脂肪沉積和相關(guān)血清生化及激素等指標(biāo)，為脂肪細(xì)胞膜免疫中和技術(shù)的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

選擇體重140g左右清潔級雌性SD大鼠96只(由南京醫(yī)科大學(xué)動物房提供)，隨機分成4組(n=24):每組共分8籠，每籠3只，大鼠自由采食和飲水，常規(guī)飼養(yǎng)管理。大鼠飼料由江浦實驗動物飼料廠提供，營養(yǎng)成分經(jīng)測定為:干物質(zhì):89.32%，粗蛋白質(zhì)24.02%，粗脂肪3.94%，灰份7.9%，鈣1.4%，總磷0.8%，鹽分1.31%。

1.2 試驗材料

試驗用陽性卵黃含脂肪細(xì)胞膜蛋白卵黃抗體，由本實驗室提取豬脂肪細(xì)胞膜蛋白，免疫蛋雞后獲得，ELISA測定抗體效價為1∶12800[3]。

1.3 試驗設(shè)計

試驗采用被動免疫方式，大鼠分灌胃組、灌胃對照組、皮下注射組和皮下注射對照組。灌胃組大鼠經(jīng)灌胃給予1 ml陽性卵黃，每3 d灌胃1次。灌胃對照組同途徑給予等量陰性卵黃。皮下注射組大鼠經(jīng)背部皮下多點注射1 ml陽性卵黃。連續(xù)注射4 d，30d后同方式加強免疫1次。皮下注射對照組同途徑給予等量陰性卵黃。

1.4 樣品采集

試驗始末均測定體重，試驗過程中測定攝食量。正式試驗75 d后進(jìn)行屠宰試驗，測定腸系膜脂肪、子宮周脂、腎脂肪囊以及腓腸肌濕重。采集血樣，分離血清后-20℃冰箱保存。

1.5 樣品分析

血清激素水平用放射免疫法(RIA)測定。胰島素試劑盒購自上海生物制品研究所;瘦素(Leptin)試劑盒購自解放軍總醫(yī)院科技開發(fā)中心放免所;腫瘤壞死因子α(TNF-α)試劑盒購自解放軍總醫(yī)院科技開發(fā)中心放免所。血清甘油三酯用甘油磷酸氧化酶法測定，試劑盒購自浙江東甌生物工程有限公司;血清膽固醇用酶終點法測定，試劑盒購自上海榮盛生物技術(shù)有限公司;血清游離脂肪酸用硫酸銅法測定，試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

以器官濕重(g)/體重(kg)表示器官指數(shù)，試驗數(shù)據(jù)以平均數(shù)()來表示，SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和結(jié)果分析。

2 結(jié)果

2.1 脂肪細(xì)胞膜蛋白卵黃抗體對大鼠生長的影響

各組大鼠的初始體重、終末體重、飼料攝入量均無顯著差異，卵黃抗體處理對大鼠每周的體增重和攝食量均無顯著影響(結(jié)果未列出)，表明脂肪細(xì)胞膜蛋白卵黃抗體對大鼠的生長和飼料利用率沒有影響(表1)。

Tab.1 Effect of oral and subcutaneous administration of IgY against APM proteins on growth and food intake of rats(，n=24，g)

Tab.1 Effect of oral and subcutaneous administration of IgY against APM proteins on growth and food intake of rats(，n=24，g)

i.g.control:Intragastric administration control;i.g.:Intragastric administration;s.c.control:Subcutaneous injection control;s.c.:Subcutaneous injection

Group Initial body weight Body weight at slaughter Body weight gain Daily food intake i.g.control 164.21±2.00 292.82±6.54 127.18±6.20 21.72±0.52 i.g. 159.10±2.70 281.56±7.43 122.25±5.02 21.75±0.23 s.c.control 162.88±2.28 289.00±5.33 126.62±4.40 21.87±0.26 s.c. 163.42±2.55 297.64±5.23 133.91±4.53 22.25±0.23

2.2 脂肪細(xì)胞膜蛋白卵黃抗體對大鼠不同部位脂肪沉積的影響

陽性卵黃灌胃分別使腸系膜脂重和腸系膜脂指數(shù)下降20.20%和17.14%;使子宮周脂重和子宮周脂指數(shù)下降28.41%和24.22%;使腎脂肪囊重和腎脂肪囊指數(shù)下降24.35%和21.62%(P＜0.05)。而皮下注射陽性卵黃后，各部位脂肪沉積及沉積指數(shù)雖有下降趨勢，但與對照相比均未達(dá)到顯著水平(表2)。

2.3 脂肪細(xì)胞膜蛋白卵黃抗體對大鼠腓腸肌生長的影響

陽性卵黃灌胃對腓腸肌和腓腸肌指數(shù)均無顯著差異，而皮下注射陽性卵黃使腓腸肌重和腓腸肌指數(shù)提高7.83%和5.20%(P＜0.05，表2)。

Tab.2 Effect of IgY against APM proteins on adipose tissue depots and growth of gastrocnemiusmuscle of rats(，n=24)

Tab.2 Effect of IgY against APM proteins on adipose tissue depots and growth of gastrocnemiusmuscle of rats(，n=24)

*P＜0.05 vs i.g.control;#P＜0.05 vs s.c.control

Group Organweight(g)Mesenteric fat Parametrial fat Perorenal fat Gastrocnemius muscle Organ index(g/kg)Mesenteric fat Parametrial fat Perorenal fat Gastrocnemius muscle i.g.control 5.06±0.407.31±0.764.53±0.421.70±0.03 17.16±1.0524.58±2.2415.32±1.255.83±0.09 i.g. 4.04±0.31*5.24±0.53*3.43±0.36*1.66±0.06 14.22±1.02*18.63±1.98*12.01±1.17*5.89±0.11 s.c.control 5.44±0.337.96±0.525.53±0.391.66±0.03 18.75±0.8727.58±1.7819.18±1.325.73±0.06 s.c. 5.41±0.287.90±0.565.39±0.481.79±0.02#18.06±0.7226.43±1.7217.95±1.486.03±0.11#

2.4 脂肪細(xì)胞膜蛋白卵黃抗體對大鼠血脂的影響

陽性卵黃灌胃使血清甘油三酯濃度下降22.33%(P＜0.05)，游離脂肪酸濃度升高32.44%(P＜0.01)。而對血清膽固醇濃度無顯著影響。皮下注射陽性卵黃可使血清甘油三酯濃度降低25.52%(P＜0.01)，但對血清游離脂肪酸和總膽固醇無顯著影響(表3)。

Tab.3 Effect of IgY against APM proteins on serum fat of rats(，n=24)

Tab.3 Effect of IgY against APM proteins on serum fat of rats(，n=24)

*P＜0.05，**P＜0.01 vs i.g.control;##P＜0.01 vs s.c.control

Group Triglycerids(g/L)Cholerterol(g/L)FFA(μmol/L)i.g.control0.41±0.02 0.55±0.04 121.72±7.47 i.g. 0.32±0.02*0.61±0.03 161.21±8.05**s.c.control0.45±0.03 0.59±0.02 135.29±7.31 s.c. 0.34±0.02##0.61±0.04 140.69±9.73

2.5 脂肪細(xì)胞膜蛋白卵黃抗體對大鼠血清Leptin、胰島素和TNF-α水平的影響

陽性卵黃灌胃可使血清leptin水平降低27.78%(P＜0.01)，血清胰島素水平降低13.94%(P＜0.05)，使血清TNF-α水平降低 10.50%(P＜0.05);皮下注射陽性卵黃使血清Leptin水平降低21.33%(P＜0.01)，使血清TNF-α水平升高19.07%(P＜0.05)，而對血清胰島素?zé)o產(chǎn)生顯著影響(表4)。

Tab.4 Effect of IgY against APM proteins on serum leptin，insulin and TNF-α(，n=24)

Tab.4 Effect of IgY against APM proteins on serum leptin，insulin and TNF-α(，n=24)

*P＜0.05，**P＜0.01 vs i.g.control;#P＜0.05，##P＜0.01 vs s.c.control

Group Leptin(ng/ml)Insulin(μU/ml)TNF-α(ng/ml)i.g.control2.16±0.14 18.94±0.70 2.00±0.08 i.g. 1.56±0.14**16.30±0.72* 1.79±0.07*s.c.control3.75±0.19 18.12±0.96 1.94±0.10s.c. 2.95±0.14##17.78±0.79 2.31±0.09#

3 討論

近年來，隨著IgY理化性質(zhì)和免疫性質(zhì)眾多優(yōu)點的發(fā)現(xiàn)，IgY在生物制品的開發(fā)和疾病防治方面的應(yīng)用已受到人們的普遍重視。IgY可以直接注射，也可以口服，液體蛋黃或固體蛋黃口服同樣有效。獸醫(yī)上口服卵黃抗體預(yù)防或治療由病毒或細(xì)菌引起的疾病已取得較好的結(jié)果。但是以往的報道主要是針對動物體內(nèi)外源性病原微生物的，而有關(guān)口服卵黃抗體對哺乳動物內(nèi)源性物質(zhì)(如脂肪細(xì)胞)的作用未見報道。

本試驗首次給生長期大鼠灌胃豬脂肪細(xì)胞膜蛋白卵黃抗體，發(fā)現(xiàn)卵黃抗體處理后顯著降低了大鼠腸系膜脂、子宮周脂和腎脂肪囊等處的脂肪沉積。這與 Futter[2]和 Panton[4]用抗血清處理大鼠，Kestin[5]和唐寶定在豬上的結(jié)果一致，表明脂肪細(xì)胞膜蛋白卵黃抗體與抗血清一樣有降低動物脂肪沉積的作用。尤其值得注意的是，卵黃抗體可通過口服途徑降低動物的脂肪沉積，且灌胃卵黃抗體的效果優(yōu)于皮下注射卵黃抗體。一般認(rèn)為，皮下注射途徑往往由于吸收快而見效迅速，但代謝快導(dǎo)致作用時間較短?？诜緩诫m然由于吸收慢而見效遲緩，但因代謝也慢，能保持較長的作用時間。此外，利用脂肪細(xì)胞膜蛋白為高度保守蛋白質(zhì)的特點，由一種動物脂肪細(xì)胞膜蛋白為抗原制備的卵黃抗體可以作用于另一種動物的脂肪細(xì)胞。

本試驗發(fā)現(xiàn)卵黃抗體處理后大鼠每周的體增重和攝食量均無顯著差異。這與文獻(xiàn)報道不盡相同。Panton[4]在大鼠、Kestin[5]在豬上的試驗均顯示抗血清注射后會引起短時間的不良反應(yīng)，如攝食量減少，增重下降，然后逐漸恢復(fù)到一般水平。造成這種差異的原因可能是因為鳥類與哺乳動物的親源關(guān)系比哺乳動物不同種類之間更遠(yuǎn)，IgY與哺乳動物特異蛋白質(zhì)產(chǎn)生免疫應(yīng)答的同時，與其他蛋白的交叉反應(yīng)較小[6]。此外，本試驗卵黃抗體皮下注射顯著促進(jìn)了腓腸肌的生長，與Kestin[5]在豬上的報道一致，而灌胃對腓腸肌生長沒有影響，有關(guān)機制尚需進(jìn)一步研究。

動物脂肪沉積與血脂水平之間存在密不可分的關(guān)系，據(jù)Hu等在大鼠和Dulor等在兔上試驗報道，被動免疫使血液游離脂肪酸和甘油三酯濃度升高，Nassar等用抗血清處理羊后，血中游離脂肪酸含量下降，而甘油三酯不受影響。唐寶定[6]在豬上的試驗表明，血液游離脂肪酸在免疫初期升高，在試驗后期沒有變化，血清甘油三酯和膽固醇不受免疫的影響。在Moloney[7]的試驗中，血中游離脂肪酸含量在免疫初期升高，隨后又顯著下降。本試驗中卵黃抗體處理可降低血清甘油三酯濃度，同時提高血清游離脂肪酸濃度，而對血清總膽固醇無顯著影響，灌胃處理的作用大于注射處理。被動免疫對動物血液中游離脂肪酸、甘油三酯和膽固醇的影響不一。這可能是因為血脂水平最終取決于脂肪細(xì)胞中脂肪的動員和其他組織對血脂的利用。

機體脂肪代謝受血液激素水平的影響，其中胰島素可以促進(jìn)脂肪的合成。本試驗中卵黃抗體注射處理對血清胰島素水平無顯著影響，這與Moloney[7]和唐寶定等的結(jié)果一致。Moloney認(rèn)為抗體可能是作用于脂肪細(xì)胞上的受體，增加脂肪細(xì)胞對胰島素的抗性，從而降低脂肪沉積。而本試驗中灌胃處理降低了胰島素水平，提示胰島素減少也是抗體降脂作用的機理之一。Leptin作為脂肪組織分泌的激素，在一定程度上可反映體脂沉積程度，它不僅抑制攝食，在能量平衡中起重要作用，還參與激發(fā)細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞數(shù)量。本試驗中卵黃抗體處理降低了血清 Leptin水平，與 Flint在大鼠上的結(jié)果一致[8]，這可能與脂肪組織減少有關(guān)，至于Leptin在卵黃抗體免疫過程中與脂肪組織減少的因果關(guān)系還有待于進(jìn)一步研究。腫瘤壞死因子α(TNF-α)可抑制脂肪細(xì)胞的分化和脂肪合成，刺激脂肪分解，并引起脂肪細(xì)胞凋亡[9]。本試驗中卵黃抗體處理改變了血清TNF-α水平，提示TNF-α參與了卵黃抗體對脂肪沉積的調(diào)節(jié)。

幾乎所有的試驗結(jié)果都表明，動物經(jīng)脂肪細(xì)胞膜蛋白抗體免疫后其脂肪沉積率有不同程度的降低，而抗體處理對動物體增重、攝食量、血脂濃度、血清激素等的影響報道不一，這可能與抗體性質(zhì)、免疫方式及時間、被免疫動物種類有關(guān)。本試驗中，灌胃處理降低TNF-α水平，注射處理卻提高TNF-α水平，以及二種處理對血清游離脂肪酸濃度、腓腸肌生長的不同影響，表明卵黃抗體不同的給予途徑可能有不同的作用機制。

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