王愛(ài)梅，湯 浩，寶東艷，于 利

(1.遼寧醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，錦州 121001;2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)教研室，遼寧 沈陽(yáng) 110001)

丹參注射液(salvia miltiorrhiza injection，SM)系由傳統(tǒng)中藥丹參提取制得，具有清除氧自由基、防止脂質(zhì)過(guò)氧化、改善微循環(huán)等多種藥理作用。研究表明，SM可有效抑制慶大霉素(gentamicin，GM)耳中毒后豚鼠耳蝸一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)的表達(dá)，以減少NO的過(guò)量生成，從而拮抗GM的耳蝸毒性[1]。已知催化合成NO的NOS異構(gòu)體有三種類(lèi)型，即神經(jīng)元型(neuronal NOS，nNOS/NOSⅠ)、誘導(dǎo)型(inducible NOS，iNOS/NOSⅡ)和內(nèi)皮型(endothelial NOS，eNOS/NOSⅢ)，SM是否對(duì)這三型NOS的表達(dá)都有影響目前尚不清楚。為此，本研究通過(guò)免疫組織化學(xué)方法及顯微圖像分析技術(shù)，結(jié)合聽(tīng)腦干反應(yīng)(auditory brainstem response，ABR)測(cè)試，觀察SM 對(duì)GM耳中毒后豚鼠耳蝸NOS三型異構(gòu)體表達(dá)的影響，以進(jìn)一步探討SM對(duì)GM耳毒性的防護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

健康白毛紅目豚鼠，耳廓反射正常，體重250～300g，雌雄不限，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)第二臨床學(xué)院動(dòng)物室提供;丹參注射液購(gòu)自上海中西制藥有限公司;硫酸慶大霉素購(gòu)自天津藥業(yè)集團(tuán)新鄭股份有限公司;兔抗nNOS/NOSⅠ和抗eNOS/NOSⅢ抗體為Santa Cruz公司產(chǎn)品，兔抗iNOS/NOSⅡ抗體為Sigma公司產(chǎn)品;即用型SABC免疫組織化學(xué)染色試劑盒和DAB顯色試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及耳毒模型制備

將豚鼠隨機(jī)分成4組(n=10):對(duì)照組、GM組、SM組和GM+SM組。GM組每日腹腔注射硫酸慶大霉素100mg/kg;SM組每日腹腔注射丹參注射液6 g/kg;GM+SM組同時(shí)注射硫酸慶大霉素和丹參注射液;對(duì)照組則每日腹腔注射與GM等量的生理鹽水2.5 ml/kg。四組皆連續(xù)用藥10d。用藥期間每天監(jiān)測(cè)動(dòng)物體重以調(diào)整藥量。

1.3 ABR測(cè)試

各組動(dòng)物于用藥前及停藥第2天分別測(cè)試ABR。操作在隔音屏蔽室內(nèi)進(jìn)行。豚鼠用1%戊巴比妥鈉40mg/kg經(jīng)腹腔麻醉后，將電極的正極置于動(dòng)物顱頂正中皮下，負(fù)極置于給聲側(cè)耳廓后下，接地電極置于對(duì)側(cè)耳廓后下。利用Danac-7型聲刺激器發(fā)出2000Hz為主的短聲(click)刺激信號(hào)，間隔90ms，帶通濾波 50～ 3000Hz，疊加 200次，掃描時(shí)程20ms。聲刺激強(qiáng)度從95 dB SPL開(kāi)始，以5 dB逐次遞減，觀察P3波以判定兩側(cè)耳的ABR閾值。

1.4 耳蝸標(biāo)本制備

待各組動(dòng)物停藥并測(cè)試完ABR后，立即斷頭處死，速取聽(tīng)泡。充分暴露耳蝸后，在體視顯微鏡下刺破前庭窗及蝸窗，蝸尖鉆孔并緩慢灌流含4%多聚甲醛的0.1 mol/L PBS(pH 7.4)，并將標(biāo)本浸入該固定液中4℃下2 h。經(jīng)PBS沖洗后放入10%的EDTA中，4℃下脫鈣20～25 d。然后移入25%蔗糖溶液中4℃過(guò)夜沉淀。用OCT包埋耳蝸，行20μm恒冷冰凍切片。

1.5 免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)NOS表達(dá)

切片干燥后用蒸餾水沖洗。0.5%H2O2室溫孵育切片30min，蒸餾水沖洗。抗原修復(fù)液處理10min，蒸餾水沖洗。以正常血清封閉液室溫下孵育切片20min后，滴加抗NOSⅠ～Ⅲ抗體(抗nNOS/NOSⅠ1∶400;抗 iNOS/NOS Ⅱ1∶4000;抗 eNOS/NOS Ⅲ 1∶100)，4℃過(guò)夜，PBS沖洗。加生物素化二抗，37℃孵育30min，PBS沖洗。加SABC試劑，37℃孵育30min，PBS 沖洗。DAB顯色，脫水，透明，封片，顯微鏡下觀察。陰性對(duì)照染色切片用0.01 mol/L PBS(pH 7.4)代替一抗，其它實(shí)驗(yàn)步驟不變。

1.6 顯微圖像分析技術(shù)

每組隨機(jī)抽取10張切片，置于顯微鏡下呈現(xiàn)圖像后，用數(shù)碼照相機(jī)拍照，并將圖像輸入計(jì)算機(jī)。應(yīng)用Luzex-F圖像分析儀，在同等條件下測(cè)量耳蝸血管紋、螺旋韌帶、螺旋器和螺旋神經(jīng)節(jié)處三型NOS陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物的灰度值，分別計(jì)算每組各部位的平均灰度值?；叶戎翟叫?，表示陽(yáng)性反應(yīng)越強(qiáng)烈。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 SM對(duì)GM耳中毒豚鼠ABR閾值的影響

連續(xù)用藥10d后，GM組ABR閾值比用藥前明顯升高，并且與對(duì)照組比較差異顯著(P＜0.01)。GM+SM組ABR閾值雖然在用藥后也有增高，但較GM組明顯降低(P＜0.01)。SM組與對(duì)照組ABR閾值無(wú)明顯差異(表1)。

Tab.1 ABR thresholds of guinea pigs in each group(，n=20ears)

Tab.1 ABR thresholds of guinea pigs in each group(，n=20ears)

ABR:Auditory brainstem response;GM:Gentamicin;SM:Salvia miltiorrhiza injection**P＜0.01 vs before administration;##P＜0.01 vs control group;△△ P＜0.01 vs GM group

Group ABR thresholds(dB SPL)Before administration After administration Control 19.5±5.5 20.5±6.4 GM 19.0±6.2 37.5±3.5**##SM 18.0±6.3 18.5±6.7 GM+SM 20.0±3.3 28.5±4.1**△△

2.2 SM對(duì)GM耳中毒豚鼠耳蝸NOS異構(gòu)體表達(dá)的影響

2.2.1 iNOS/NOSⅡ 光鏡下觀察，可見(jiàn)對(duì)照組豚鼠耳蝸中iNOS的陽(yáng)性染色較弱，其免疫反應(yīng)產(chǎn)物呈棕黃色顆粒，分布于耳蝸血管紋(stria vascularis，SV)、螺旋韌帶(spiral ligament，SL)、螺旋器(the organ of Corti)和螺旋神經(jīng)節(jié)(spiral ganglion，SG)細(xì)胞的胞漿內(nèi)。GM組、SM組和GM+SM組豚鼠耳蝸中iNOS陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物的分布與對(duì)照組大致相同，但GM組的陽(yáng)性染色比對(duì)照組明顯加深，陽(yáng)性顆粒顯著增多，而GM+SM組的陽(yáng)性染色則較GM組明顯減弱(圖1～3)。顯微圖像分析結(jié)果顯示，GM組豚鼠耳蝸各部位iNOS免疫反應(yīng)的平均灰度值較對(duì)照組明顯減小(P＜0.01)，即GM 組耳蝸iNOS表達(dá)顯著增強(qiáng);而GM+SM組豚鼠耳蝸iNOS免疫反應(yīng)的平均灰度值則較GM組有所增大，即iNOS表達(dá)明顯弱于GM組(P＜0.05，P＜0.01，表2)。

Tab.2 Average gray value of iNOS immunoactivity in the guinea pig cochleae of each group(，n=10)

Tab.2 Average gray value of iNOS immunoactivity in the guinea pig cochleae of each group(，n=10)

SV:Stria vascularis;SL:Spiral ligament;SG:Spiral ganglion;GM:Gentamicin;SM:Salvia miltiorrhiza injection**P＜0.01 vs control group;#P＜0.05，##P＜0.01 vs GM group

Group Average gray value SV SL Organ of Corti SG Control 110.48±10.60 125.15±10.80 127.59±6.32 116.91±8.72 GM 90.01±9.02** 101.30±9.14** 102.31±7.51** 97.44±7.92**SM 111.20±9.89 126.13±9.54 128.18±8.14 119.06±9.66 GM+SM 99.89±6.19# 114.67±9.49## 116.67±6.18## 108.28±6.73##

Fig.1 Expression of iNOS in the SV and SL of guinea pig cochleae(SABC method of immunohistochemistry，cryostat section×200)

Fig.2 Expression of iNOS in the organ of Corti of guinea pig cochleae(SABC method of immunohistochemistry，cryostat section×200)

2.2.2 nNOS/NOSⅠ和eNOS/NOSⅢ 光鏡下可見(jiàn)，各組豚鼠耳蝸中nNOS和eNOS陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物亦為棕黃色顆粒，并且與iNOS的分布大致相同，但各組間nNOS和eNOS陽(yáng)性染色無(wú)明顯差別。顯微圖像分析結(jié)果表明，各組間nNOS和eNOS免疫反應(yīng)的平均灰度值無(wú)顯著性差異。

Fig.3 Expression of iNOS in the SG of guinea pig cochleae(SABC method of immunohistochemistry，cryostat section ×400)

2.3 豚鼠耳蝸各部位 iNOS免疫反應(yīng)的平均灰度值與ABR閾值的關(guān)系

連續(xù)給藥10d后，各組豚鼠耳蝸不同部位iNOS免疫反應(yīng)的平均灰度值發(fā)生變化，同時(shí)伴有ABR閾值的改變，提示二者之間關(guān)系密切。通過(guò)直線相關(guān)檢驗(yàn)證明二者高度相關(guān)(|r|＞0.7，表3)，表明iNOS表達(dá)越強(qiáng)，ABR閾值越高。

Tab.3 Correlation between average gray value of iNOS immunoactivity and ABR thresholds of guinea pig from each group(，n=10)

Tab.3 Correlation between average gray value of iNOS immunoactivity and ABR thresholds of guinea pig from each group(，n=10)

SV:Stria vascularis;SL:Spiral ligament;SG:Spiral ganglion;GM:Gentamicin;SM:Salvia miltiorrhiza injection**P＜0.01

Correlation coefficient SV SL Organ of Corti SG rControl -0.951**-0.973** -0.956** -0.952**rGM -0.878**-0.900** -0.861** -0.802**rSM -0.973**-0.916** -0.895** -0.933**rGM+SM -0.951**-0.932** -0.855** -0.905**

3 討論

研究表明，NOS三型異構(gòu)體均存在于豚鼠耳蝸結(jié)構(gòu)中，并且可在生理狀態(tài)下表達(dá)其活性[2，3]，而病理狀態(tài)下iNOS的誘導(dǎo)表達(dá)及其產(chǎn)生的大量NO可能參與了內(nèi)耳疾病的發(fā)病過(guò)程[4，5]。Shi等[4]發(fā)現(xiàn)噪聲暴露可誘導(dǎo)豚鼠耳蝸螺旋器毛細(xì)胞及SV邊緣細(xì)胞內(nèi)iNOS的高表達(dá)，提示iNOS參與了噪聲所致聽(tīng)力喪失。Watanabe等[5]報(bào)道給予耳毒性藥物順鉑后，小鼠耳蝸SV和SL中iNOS表達(dá)增強(qiáng)，同時(shí)伴有ABR閾移增大，提示iNOS介導(dǎo)了順鉑的耳毒性，導(dǎo)致聽(tīng)力喪失。本研究結(jié)果顯示，單獨(dú)接受GM注射10d后，豚鼠耳蝸SV、SL、螺旋器和SG細(xì)胞中iNOS表達(dá)明顯增強(qiáng)，且與ABR閾值升高高度相關(guān)，表明iNOS及其產(chǎn)生的大量NO也參與了GM耳中毒過(guò)程，進(jìn)一步證實(shí)了本研究室的前期工作結(jié)果。此外，我們還觀察到，GM耳中毒后，豚鼠耳蝸各部位nNOS和eNOS的表達(dá)與對(duì)照組比較并無(wú)顯著性差異，這與Hess等[6]的報(bào)道相似。他們將細(xì)菌性脂多糖和腫瘤壞死因子α的混合物注入豚鼠鼓室腔后，耳蝸nNOS和eNOS的表達(dá)也無(wú)改變。綜合我們的研究結(jié)果，提示GM可能并不影響nNOS和eNOS的表達(dá)，而是通過(guò)使iNOS表達(dá)顯著增強(qiáng)，進(jìn)而產(chǎn)生過(guò)量的NO，引起耳蝸損害，導(dǎo)致聽(tīng)力喪失。

SM主要是中藥丹參的水溶性成分，包括丹參素、丹參酮及丹酚酸等。近來(lái)的研究表明，SM及其有效單體均可通過(guò)抑制iNOS的表達(dá)而發(fā)揮防護(hù)作用，如SM可抑制慢性缺氧大鼠肺小動(dòng)脈內(nèi)iNOS的表達(dá)，從而影響缺氧性肺動(dòng)脈高壓形成中的肺小動(dòng)脈重構(gòu)[7];丹參酮能降低β淀粉樣蛋白誘導(dǎo)的iNOS高表達(dá)，從而防護(hù)β淀粉樣蛋白對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元的損傷[8]。此外，SM還可明顯降低鏈霉素所致豚鼠ABR閾值升高，并可抑制耳蝸SG細(xì)胞內(nèi)iNOS的過(guò)表達(dá)，從而減輕耳毒性損傷[9]。本研究結(jié)果顯示，GM+SM組豚鼠耳蝸SV、SL、螺旋器以及SG細(xì)胞中nNOS、eNOS和iNOS的分布均與GM 組相同，且其nNOS和eNOS表達(dá)與GM組比較無(wú)顯著性差異，但iNOS表達(dá)則明顯弱于GM組，同時(shí)豚鼠ABR閾值也顯著降低，并且與iNOS表達(dá)下調(diào)高度相關(guān)。由此提示，SM雖然對(duì)GM耳中毒后豚鼠耳蝸各部位nNOS和eNOS表達(dá)無(wú)明顯影響，但可抑制GM所致iNOS表達(dá)的增強(qiáng)，以減少NO的過(guò)量生成，從而發(fā)揮對(duì)GM耳毒性的防護(hù)作用。至于SM下調(diào)GM耳中毒豚鼠耳蝸iNOS表達(dá)的具體機(jī)制，還有待于今后更深入的研究。

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