李賢慧，張新昌，王 剛，劉海玲，夏時海

(武警醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)教研室，天津 300162)

神經(jīng)活性甾體(neuroactive steroids)是由膽固醇或其前體在相應(yīng)酶的作用下，在神經(jīng)系統(tǒng)原位合成或經(jīng)血腦屏障進(jìn)入神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮作用的外周甾體及其代謝衍生物的統(tǒng)稱[1-2]。研究表明神經(jīng)甾體可以通過基因效應(yīng)和非基因效應(yīng)調(diào)節(jié)神經(jīng)元的功能，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中可發(fā)揮廣泛的生物學(xué)活性[3-4]，如參與神經(jīng)細(xì)胞的生長發(fā)育、成熟衰老、情緒反應(yīng)、記憶過程，還參與焦慮、抑郁、驚厥、癲癇等調(diào)節(jié)過程。近年來，神經(jīng)活性甾體對神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)作用日益受到關(guān)注，對防治各種神經(jīng)退行性疾病極具潛力[5]。別孕烯醇酮是重要的神經(jīng)活性甾體之一，它能對抗缺血引起的γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)受體功能減低[6]，還能對抗外傷性和缺血性腦損傷引起的細(xì)胞凋亡[7]，為此我們利用N-甲基-D-天門冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)誘發(fā)新生小鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元損傷模型，探討神經(jīng)活性甾體別孕烯醇酮對腦皮質(zhì)神經(jīng)元的保護(hù)作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和設(shè)備

DMEM/F12培養(yǎng)基為GIBCO公司產(chǎn)品;胎牛血清為Hyclone產(chǎn)品;Trizol試劑為Invitrogen產(chǎn)品;多聚賴氨酸(PLL)，胰蛋白酶(Trypsin)，N-甲基-D-天門冬氨酸(NMDA)，別孕烯醇酮(allopregnanolone，Allo)均為 Sigma產(chǎn)品。兔多克隆 anti-Akt，anti-pAkt(Ser473)購自 Cell Signaling公司，兔多克隆Anticleaved caspase-3，Anti-cleaved caspase-9，Anti-cleaved PARP購自美國Abcam公司;小鼠抗α-tubulin單克隆抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology公司;HRP標(biāo)記的羊抗鼠、羊抗兔二抗購自北京中山生物技術(shù)公司;凋亡DNA-Ladder提取試劑盒購自北京普利來基因技術(shù)有限公司;CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，美國Forma Scientific公司;倒置顯微鏡，德國Leica DMIL產(chǎn)品;Evergene凝膠成像分析系統(tǒng)，冷泉港公司。

1.2 原代腦皮質(zhì)神經(jīng)元培養(yǎng)

新生3 d小鼠低溫麻醉后無菌條件下取腦，超凈臺內(nèi)剪碎，加0.125%胰蛋白酶消化成均勻的細(xì)胞懸液，計數(shù)后1.0×106cells/ml細(xì)胞密度接種于L-多聚賴氨酸包被的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，DMEM/F12，10%胎牛血清培養(yǎng)液中含阿糖胞苷(終濃度3μg/ml)抑制非神經(jīng)細(xì)胞生長，置于CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。每2 d更換1/2新鮮培養(yǎng)液，培養(yǎng)9 d后用于實驗。

1.3 別孕烯醇酮對原代腦皮質(zhì)神經(jīng)元的作用

培養(yǎng)9 d的腦皮質(zhì)神經(jīng)元，棄去培養(yǎng)液，PBS漂洗1次，再用培養(yǎng)液沖洗1次;加入含有Allo的培養(yǎng)液，終濃度分別為 0.5×10-6mol/L、1×10-6mol/L和5×10-6mol/L;實驗分兩組，Allo作用45 min組用于磷酸化Akt的免疫印記檢測;Allo作用24h組用于β2-GABA受體mRNA的RT-PCR檢測。

1.4 RT-PCR檢測β2-GABA受體mRNA的表達(dá)

用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA;逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA ，將 2μg 總 RNA 與 2μl隨機(jī)引物(0.5μg/μl)混合，加DEPC水補(bǔ)足至終體積 12.5μl。70℃水浴變性5 min，然后立刻置冰上5 min;再加入下列試劑:M-MLV 5 ×Reaction Buffer 4μl，dNTP(10mmol/L)2μl，RNasin(40U/μl)(RNA 抑制 劑)0.5μl，MMLV(200U/μl)1μl，總體積 20μl，混勻 ，瞬時離心(5000×g，30s)，42℃反應(yīng) 1 h，85℃滅活 5 min，5000×g離心1 min，保存于-70℃?zhèn)溆谩?/p>

按常規(guī)方法PCR擴(kuò)增，引物序列見表1，反應(yīng)參數(shù)為95℃預(yù)變性 3 min，95℃30s，72℃延伸 30s，GAPDH退火溫度58℃，25個循環(huán);β2-GABA-R退火溫度60℃，30個循環(huán)。2%瓊脂糖凝膠電鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物泳(表1)。

Tab.1 Sequence of primers and length of PCR products

1.5 Western-blot檢測磷酸化Akt

收集并裂解細(xì)胞，BCA試劑盒測定細(xì)胞總蛋白濃度，每空 30μg上樣，10%SDS-PAGE 電泳分離 ，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉，一抗 anti-pAkt(Ser 473)4℃孵育過夜;TBST洗膜后二抗孵育;TBST洗膜后，將化學(xué)發(fā)光劑A液、B液混合，滴加于膜上孵育3 min，然后用保鮮膜裹好，于暗室中進(jìn)行X光壓片，曝光、顯影、定影。

1.6 NMDA誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡及實驗分組

取培養(yǎng)9 d的腦皮質(zhì)神經(jīng)元，PBS漂洗1次，再用培養(yǎng)液沖洗1次;加入含有Allo的培養(yǎng)液，30min后再加入NMDA(終濃度1×10-3mol/L)、甘氨酸(終濃度2×10-4mol/L)，作用60min后換成正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24h。

實驗分組，(1)對照組:正常培養(yǎng)液;(2)Allo 5×10-6mol/L預(yù)處理組:Allo終濃度5×10-6mol/L，NMDA終濃度1×10-3mol/L;(3)Allo 1×10-6mol/L預(yù)處理組:Allo終濃度1×10-6mol/L，NMDA終濃度1×10-3mol/L;(4)NMDA組:NMDA終濃度1×10-3mol/L。

1.7 凋亡DNA-Ladder檢測

收集各組細(xì)胞，每組5×106，詳細(xì)步驟按凋亡DNA-Ladder提取試劑盒(北京普利來)說明書操作。1%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，Evergene凝膠成像分析系統(tǒng)成像。

1.8 Western blot檢測PARP、caspase-3和 caspase-9的裂解片段

特異抗體分別為Anti-cleaved caspase-3、Anticleaved caspase-9 和 Anti-cleaved PARP，用 12%SDSPAGE電泳分離，其它基本方法步驟同1.5。

2 結(jié)果

2.1 別孕烯醇酮可促進(jìn)腦皮質(zhì)神經(jīng)元β2-GABA受體的表達(dá)

RT-PCR檢測結(jié)果顯示與對照相比，0.5×10-6mol/L、1×10-6mol/L和5×10-6mol/L濃度的別孕烯醇酮均能促進(jìn)β2-GABA受體mRNA的表達(dá)，密度掃描分析表明隨著別孕烯醇酮濃度的增加(0.5×10-6mol/L、1×10-6mol/L和5×10-6mol/L)，β2-GABA 受體mRNA的表達(dá)量分別升高1.73±0.23倍、3.65±0.37倍和5.87±0.51倍(圖1)。

Fig.1 Allopregnanolone(Allo)increased the expression of β2-GABA-R mR NAs in primary cerebral cortical neuronal cells()

2.2 別孕烯醇酮使腦皮質(zhì)神經(jīng)元Akt磷酸化增加

Western blot檢測結(jié)果顯示與對照相比，0.5×10-6mol/L、1×10-6mol/L和5×10-6mol/L濃度的別孕烯醇酮均能促進(jìn)磷酸化型Akt(pAkt-Ser473)的增加，Western blot結(jié)果密度掃描分析表明隨著別孕烯醇酮濃度的增加(0.5×10-6mol/L、1×10-6mol/L和5×10-6mol/L)，pAkt-Ser473的增加量分別為2.62±0.31倍、3.85±0.55倍和4.23±0.42倍(圖2)。

Fig.2 Allopregnanolone(Allo)increased Akt phosphorylation in primary cerebral cortical neuronal cells(ˉx ± s)

2.3 別孕烯醇酮對NMDA誘發(fā)腦皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡有保護(hù)作用

DNA-Ladder分析表明，1×10-6mol/L別孕烯醇酮預(yù)處理大鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元可使NMDA誘發(fā)的DNA-Ladder減弱，但5×10-6mol/L預(yù)處理組DNALadder減弱更明顯;Western blot檢測表明，與單純NMDA誘發(fā)凋亡組比較，1×10-6mol/L別孕烯醇酮預(yù)處理能抵抗NMDA誘發(fā)的凋亡，使活化型PRAP、Caspase-9、Caspase-3的相對表達(dá)量從5.6±0.11、5.9±0.23、6.9±0.46分別降至4.2±0.26、3.8±0.34、4.3±0.29;而5×10-6mol/L別孕烯醇酮預(yù)處理組對NMDA誘發(fā)凋亡的抵抗效果更顯著，使活化型PRAP、Caspase-9、Caspase-3的相對表達(dá)量分別降至1.3±0.2、1.1±0.23、1.7±0.09(圖3)。

Fig.3 Pretreatment with Allopregnanolone(Allo)showed to be neuroprotective on NMDA-induced neuronal cells apoptosis()

3 討論

研究表明神經(jīng)活性甾體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的效應(yīng)分為兩類。一類是基因效應(yīng)即神經(jīng)活性甾體分子與細(xì)胞內(nèi)受體結(jié)合，入核后激活轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá);另一類是非基因效應(yīng)即與細(xì)胞膜上的神經(jīng)遞質(zhì)受體如?-氨基丁酸受體、N-甲基-D-天冬氨酸受體等識別結(jié)合而快速發(fā)揮作用[1-2]。在我們的實驗中腦皮質(zhì)神經(jīng)元經(jīng)別孕烯醇酮(終濃度為0.5×10-6mol/L、1×10-6mol/L和 5×10-6mol/L)作用 24h后，RT-PCR分析表明β2-GABA受體mRNA轉(zhuǎn)錄增加，提示別孕烯醇酮對腦皮質(zhì)神經(jīng)元可產(chǎn)生基因效應(yīng);而作用45 min后，Western blot檢測證明絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶B(Akt)磷酸化增加，提示別孕烯醇酮對腦皮質(zhì)神經(jīng)元也可通過神經(jīng)遞質(zhì)受體產(chǎn)生瞬時的非基因效應(yīng)。我們進(jìn)一步的實驗表明終濃度5×10-6mol/L的別孕烯醇酮預(yù)處理30min，對NMDA誘發(fā)的腦皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡可產(chǎn)生明顯的抵抗作用;提示其作用機(jī)制可能是通過促進(jìn)Akt磷酸化和干擾內(nèi)在的線粒體凋亡途徑而抑制NMDA引起的興奮性中毒[8]。而Veleiro等[9]的研究表明神經(jīng)甾體通常是GABA受體的激動劑，可以通過增加氯離子內(nèi)流而增強(qiáng)GABA的抑制作用是某些神經(jīng)甾體減弱神經(jīng)細(xì)胞興奮性毒性的機(jī)制之一，則提示別孕烯醇酮可能通過調(diào)節(jié)GABA受體的活性進(jìn)而引起Akt磷酸化增加，對神經(jīng)元的凋亡起保護(hù)作用。另外我們的實驗還表明別孕烯醇酮對腦皮質(zhì)神經(jīng)元也有基因效應(yīng)，而且Marx的研究表明腦中別孕烯醇酮降低與Alzheimer's疾病相關(guān)[10]，預(yù)示著別孕烯醇酮對慢性神經(jīng)退行性疾病的預(yù)防和治療也有一定的前景。

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