楊 波，任曉麗，張 鈞，余 清△

(1.溫州醫(yī)學(xué)院環(huán)境與公共衛(wèi)生學(xué)院，2.溫州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，浙江 溫州 325035;3.揚(yáng)州大學(xué)運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)研究所，江蘇 揚(yáng)州 225009)

一氧化氮(nitric oxide，NO)和內(nèi)皮素(endothelin，ET)是血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放調(diào)節(jié)血管張力的主要活性物質(zhì)，生理狀態(tài)下NO介導(dǎo)血管平滑肌舒張與ET介導(dǎo)血管收縮平衡是調(diào)控血管張力的主要系統(tǒng)，ET可與血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)皮B受體(ETB)結(jié)合誘導(dǎo)一氧化氮合成酶(nitric oxide synthetase，NOS)活性增加，促進(jìn)NO合成與分泌，經(jīng)NO-GC-cGMP通路介導(dǎo)血管擴(kuò)張，從而拮抗ET的縮血管作用;而cGMP又可以抑制ET-1mRNA表達(dá)[1]，使ET-1生成降低。所以NO/ET系統(tǒng)紊亂，提示血管張力調(diào)節(jié)障礙，可能是動(dòng)脈粥樣硬化早期病變表現(xiàn)之一[2]。同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)也稱高半胱氨酸，是體內(nèi)蛋氨酸循環(huán)代謝形成的中間產(chǎn)物，大量臨床研究表明，攝入過(guò)多含有蛋氨酸的食品會(huì)導(dǎo)致血漿Hcy升高，超過(guò)正常值范圍(5～15μmol/L)，可誘發(fā)高同型半胱氨酸血癥致血管內(nèi)皮功能障礙，導(dǎo)致NO/ET比例失衡，血管痙攣和血管張力調(diào)節(jié)障礙，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化(arteriosclerosis，AS)的發(fā)生與發(fā)展。適宜的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可以改善血管內(nèi)皮功能，調(diào)節(jié)體內(nèi)NO/ET平衡狀態(tài)，從而發(fā)揮抗血管痙攣?zhàn)饔?，降低AS和其它心血管疾病的發(fā)病率。本研究通過(guò)對(duì)高蛋氨酸飲食大鼠進(jìn)行運(yùn)動(dòng)干預(yù)，探討有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)高蛋氨酸飲食大鼠T-NOS、NO、ET含量和NO/ET平衡狀態(tài)的影響，為預(yù)防高同型半胱氨酸血癥和動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生提供新的研究思路。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組

選用健康雄性8周齡Wistar大鼠30只，體重(155±5)g，由中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。習(xí)服飼養(yǎng)后，隨機(jī)分為3組:正常飲食對(duì)照組(對(duì)照組，CR)、高蛋氨酸飼料組(高蛋氨酸組，MR)和有氧運(yùn)動(dòng)+高蛋氨酸飲食組(運(yùn)動(dòng)干預(yù)組，T+MR)。

1.2 建立高同型半胱氨酸血癥大鼠模型

按照文獻(xiàn)[3]方法建立高同型半胱氨酸血癥大鼠模型。即:除對(duì)照組外，高蛋氨酸組和運(yùn)動(dòng)干預(yù)組大鼠喂飼3%高蛋氨酸飼料飲食，持續(xù)8周，并分別記錄各組大鼠日平均攝食總量。高蛋氨酸飼料由南京安立默實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料有限公司加工制作，L-蛋氨酸為上海斐雅科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品，批號(hào)為20040210，符合AJ192版產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。飼料在制成顆粒以前，將原料分為兩部分，一部分直接加工成普通飼料，另一部分按3%的比例添加蛋氨酸，制成顆粒飼料。

1.3 運(yùn)動(dòng)方式

適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，運(yùn)動(dòng)干預(yù)組大鼠除每日喂飼高蛋氨酸飼料外，進(jìn)行90min無(wú)負(fù)重游泳運(yùn)動(dòng)，每周6 d。第1天運(yùn)動(dòng)時(shí)間為10min，以后每天遞增10min，至周末增至60min，第 2周每天遞增5 min，至周末增至90min。以后每天維持此運(yùn)動(dòng)時(shí)間，持續(xù)8周。

1.4 取樣

飼養(yǎng)8周后，各實(shí)驗(yàn)組禁食24h后，稱重并依次用2%戊巴比妥鈉(50mg/kg)腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈取血，部分血樣注入 120μl含2%的 EDTA-Na2的無(wú)菌抗凝試管中，供Hcy、T-NOS和NO檢測(cè);余下注入 10%EDTA-Na 230μl和抑肽酶 40μl的抗凝管中，供血漿ET測(cè)定。常規(guī)制備血漿，-20℃以下冰箱保存、待測(cè)。

1.5 測(cè)試方法

1.5.1 大鼠日平均攝食總量 飼養(yǎng)期開(kāi)始，各組大鼠給予等量顆粒飼料D1，次日清晨大鼠游泳訓(xùn)練結(jié)束后，將該組剩余食物稱重(D2)，兩次紀(jì)錄之差求和后除以各組大鼠只數(shù)和實(shí)驗(yàn)天數(shù)即為大鼠日平均攝食總量(D)，即

1.5.2 血漿同型半胱氨酸測(cè)定 試劑盒由北京阜外心血管病院中德分子醫(yī)學(xué)中心提供。采用高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定，參照黃其摯等[4]的方法進(jìn)行測(cè)定。

1.5.3 內(nèi)皮素、一氧化氮合成酶和一氧化氮測(cè)定嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書分別采用放射免疫非平衡法、比色法和硝酸酶還原法，試劑盒由中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院科技開(kāi)發(fā)中心放射免疫研究所和南京建成生物工程研究所提供。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 大鼠日平均攝食總量和實(shí)驗(yàn)前、后體重比較

與實(shí)驗(yàn)前相比，實(shí)驗(yàn)后各組大鼠體重均有所增長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)后，高蛋氨酸組和運(yùn)動(dòng)干預(yù)組大鼠體重均低于對(duì)照組，運(yùn)動(dòng)干預(yù)組大鼠體顯著低于高蛋氨酸組(P＜0.01)，表明高蛋氨酸飲食對(duì)大鼠體重有明顯的抑制作用;游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)高蛋氨酸飲食大鼠體重的增長(zhǎng)有抑制作用。

單因素方差分析表明，各組大鼠飼養(yǎng)期間日平均攝食總量無(wú)顯著性差異(F=2.140，P=0.122)，對(duì)照組大鼠日平均攝食總量略高于高蛋氨酸組和運(yùn)動(dòng)干預(yù)組，差異無(wú)顯著性(表1)。

Tab.1 Comparation of rats'equal daily diet and body weight among groups(，n=10)

Tab.1 Comparation of rats'equal daily diet and body weight among groups(，n=10)

CR:Normal diet group;MR:High methionine diet group;T+MR:High methionine diet plus 90min swimming group**P＜0.01 vs CR;##P＜0.01 vs MR

Group Body weight(g)Before test After test Equal daily diet(g/d)CR 152.5±3.9 384.2±9.5 20.39±2.34 MR 153.4±2.9 268.9±10.1** 19.07±3.15 T+MR 152.4±4.7 240.0±11.3**##19.34±3.86

2.2 大鼠血漿同型半胱氨酸含量比較

與對(duì)照組相比，高蛋氨酸組大鼠血漿Hcy含量顯著升高(P＜0.01)，是對(duì)照組的2倍以上。與高蛋氨酸組相比，運(yùn)動(dòng)干預(yù)組血漿Hcy顯著下降(P＜0.01)，且與對(duì)照組相比差異無(wú)顯著性(表2見(jiàn)下頁(yè))。

Tab.2 Comparation of rats'plasma content of the Hcy among groups(，n=10)

Tab.2 Comparation of rats'plasma content of the Hcy among groups(，n=10)

**P＜0.01 vs CR;##P＜0.01 vs MR

Group Homocysteine(μmol/L)CR 8.670±1.881 MR 23.020±3.912**T+MR 11.400±2.199##

2.3 大鼠血漿T-NOS、NO、ET含量和NO/ET比值比較

與對(duì)照組相比，高蛋氨酸組血漿T-NOS、NO含量顯著下降，血漿ET含量顯著升高(P＜0.05)，NO/ET比值顯著降低(P＜0.01);與高蛋氨酸組相比，運(yùn)動(dòng)干預(yù)組大鼠血漿總NOS活力、NO含量和NO/ET比值顯著升高(P＜0.05)，血漿內(nèi)皮素含量下降無(wú)顯著性，且與對(duì)照組相比各項(xiàng)指標(biāo)差異均無(wú)顯著性(表3)。

Tab.3 Comparation of rats'plasma of the NOS，NO，ET and NO/ET among groups(，n=10)

Tab.3 Comparation of rats'plasma of the NOS，NO，ET and NO/ET among groups(，n=10)

*P＜0.05，**P＜0.01 vs CR;#P＜0.05 vs MR

Group T-NOS(U/L) NO(umol/L) ET(pg/ml) NO/ET CR 7.314±0.399 60.12±5.75 95.86±4.43 0.639±0.039 MR 5.313±0.700** 45.24±5.09* 105.90±7.67* 0.429±0.062**T+MR 6.353±0.702# 55.68±6.81# 100.30±5.34 0.560±0.095#

3 討論

Hcy是蛋氨酸代謝的中間產(chǎn)物，血漿Hcy水平升高是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素。研究表明，采用高蛋氨酸飼料可以誘導(dǎo)高同型半胱氨酸血癥發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)選用雄性健康Wistar大鼠，用含3%蛋氨酸飼料喂養(yǎng)8周后，高蛋氨酸飲食組大鼠血漿同型半胱氨酸含量達(dá)(23.02±3.91)μmol/L，是對(duì)照組的兩倍以上，血漿T-NOS、NO 含量顯著下降，ET含量顯著升高，表明高蛋氨酸飲食可以誘發(fā)大鼠高同型半胱氨酸血癥，導(dǎo)致NO/ET失衡，血管張力調(diào)節(jié)障礙，而血管舒張功能降低是動(dòng)脈粥樣硬化最早的表現(xiàn)[2]。

高同型半胱氨酸血癥致內(nèi)皮功能障礙可能與氧自由基的生成有關(guān)[5-6]。高半胱氨酸在胞內(nèi)合成后，可以通過(guò)細(xì)胞內(nèi)外的濃度梯度主動(dòng)或被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外液，造成血液Hcy異常升高，其-SH自身氧化生成大量的過(guò)氧化氫(H2O2)、超氧陰離子自由基(O2-?)和羥自由基(OH?)，這些活性氧離子一方面可與NO結(jié)合，生成具有強(qiáng)烈細(xì)胞毒性作用的過(guò)氧亞硝酸鹽(ONOO-)，引起內(nèi)皮功能障礙;另一方面，活性氧自由基也可以直接誘導(dǎo)eNOS分子變構(gòu)而降低T-NOS活性[7]，兩者最終導(dǎo)致NO的生成和釋放缺陷。研究發(fā)現(xiàn)糖耐量異?；颊哐獫{Hcy與ET-1水平呈正相關(guān)[8]，提示Hcy可以刺激ET的釋放增加。本研究表明高Hcy致NO/ET系統(tǒng)失衡，表現(xiàn)為高ET和低NO，平衡傾向于ET。其原因可能是由于內(nèi)皮細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間暴露于高Hcy體液中，導(dǎo)致ONOO-生成增加而引起NO的釋放和利用下降，同時(shí)大量氧自由基的生成也可以降低NOS活性，進(jìn)一步造成NO的合成減少，從而減弱NO-GC-cGMP途徑對(duì)ET-1mRNA表達(dá)的抑制作用[1]，使ET-1生成增加。

有關(guān)運(yùn)動(dòng)與高半胱氨酸的關(guān)系國(guó)內(nèi)報(bào)道較少。Heather K.等[9]報(bào)道了采用抗阻訓(xùn)練可以降低超重和肥胖人群的血漿同型半胱氨酸含量，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，有氧運(yùn)動(dòng)可以預(yù)防由于蛋氨酸攝入過(guò)量而引起的血漿Hcy水平升高，可能與其增強(qiáng)Hcy代謝有關(guān)。有氧運(yùn)動(dòng)作為一種改善血管內(nèi)皮功能而有效預(yù)防動(dòng)脈硬化的手段之一，已在實(shí)踐中廣泛應(yīng)用，大量研究報(bào)道均表明有氧運(yùn)動(dòng)能改善血管內(nèi)皮功能并促進(jìn)機(jī)體內(nèi)NO的生成和釋放，由于NO可經(jīng)cGMP途徑抑制ET-1的產(chǎn)生，導(dǎo)致NO/ET比值升高。Miyaki A等[10]研究發(fā)現(xiàn)有氧運(yùn)動(dòng)可以增加超重成年人血漿NO而減少ET含量，本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示運(yùn)動(dòng)干預(yù)組大鼠血漿NO含量和NOS活性顯著升高(P＜0.01)，NO/ET顯著提高(P＜0.05)，且運(yùn)動(dòng)組各項(xiàng)指標(biāo)與對(duì)照組相比均無(wú)顯著性差異，表明適宜運(yùn)動(dòng)能明顯改善高蛋氨酸飲食大鼠血漿NO、ET含量和NO/ET平衡，為預(yù)防高同型半胱氨酸血癥導(dǎo)致血管張力調(diào)節(jié)障礙提供理論依據(jù)。由此可見(jiàn)，有氧運(yùn)動(dòng)可以明顯通過(guò)提高高蛋氨酸飲食大鼠血管內(nèi)皮TNOS活力，增加NO的合成與釋放，從而調(diào)節(jié)Hcy引起NO/ET失衡，這可能是有氧運(yùn)動(dòng)預(yù)防高同型半胱氨酸血癥所致血管舒張功能下降誘發(fā)AS發(fā)生的機(jī)制之一。

綜上所述，高蛋氨酸飲食可以誘發(fā)大鼠高同型半胱氨酸血癥，NO/ET系統(tǒng)失衡;長(zhǎng)期中等負(fù)荷的有氧運(yùn)動(dòng)可以降低高蛋氨酸飲食大鼠血漿Hcy水平，明顯改善NO/ET失衡，預(yù)防高同型半胱氨酸血癥。

[1]Julian C G，Galan H L，Wilson M J，et al.Lower uterine artery blood flow and higher endothelin relative to nitric oxide metabolite levels are associatedwith reductions in birthweight at high altitude[J].Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2008，295(3):R906-915.

[2]Lentz S R，Sobey C G，Piegors D J，et al.Vascular dysfunction in monkeys with diet-induced hyperhomocysteinemia[J].J Clin Inves，1996，98(1):24-29.

[3]蔡?hào)|聯(lián)，陳小莉.高蛋氨酸飲食對(duì)大鼠生長(zhǎng)及氨基酸代謝的影響[J].中國(guó)臨床營(yíng)養(yǎng)雜志，2002，10(4):248-251.

[4]Huang Q Q，Hui R T，Zhang C L.Application of HPLC for determination of homocysteine level in plasma[J].Int J Med，1999，3(1):50-52.

[5]Mendes R H，Sirvente R A，Candido G O，et al.Homocysteine thiolactone induces cardiac dysfunction:Role of oxidative stress[J].J CardiovascPharmacol，2010，55(2):198-202.

[6]Fujimi K，Uehara Y，Abe S，et al.Homocysteine-inducedoxidative stress upregulates chymase in mouse mastectomy cells[J].HypertensRes，2010，33(2):149-154.

[7]Topal G，Brunet A，Millanvoye E，et al.Homocysteine induces oxidative stress by uncoupling of no synthase activity through reduction of tetrahydrobiopterin[J].Free Radic Biol Med，2004，36(12):1532-1541.

[8]Gottsater A，Anwaar I，Eriksson K F，et al.Homocysteine is related to neopterin and endothelin-1 in plasma of subjects with disturbed glucose metabolism and reference subjects[J].Angiol，2000，51(6):489-497.

[9]Vincent H K，Bourguignon C，Vincent K R.Resistance training lowers exercise-inducedoxidative stressand homocysteine levels in overweight and obese older adults[J].Obesity(Silver Spring)，2006，14(11):1921-1930.

[10]Miyaki A，Maeda S，Yoshizawa M，et al.Effect of habitual aerobic exercise on body weight and arterial function in overweight and obese men[J].Am J Cardiol，2009，104(6):823-828.