苗愛東 楊 靜 王彥宗

北京軍區(qū)聯(lián)勤部藥品儀器檢驗(yàn)所，北京 100071

克拉霉素片為《中國藥典》2010年版二部收載品種[1]，屬大環(huán)內(nèi)酯類藥物，臨床上常用于鼻咽感染、下呼吸道感染、皮膚軟組織感染、急性中耳炎、肺炎支原體肺炎、軍團(tuán)菌感染、沙眼衣原體引起的尿道炎及宮頸炎等的治療[2]?？死顾仄暮繙y(cè)定方法為HPLC外標(biāo)一點(diǎn)法[1]，本文根據(jù)《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》（JJFl059-1999）、《化學(xué)分析測(cè)量不確定度評(píng)定》（JJF1135-2005）和《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》（CNAS-GL06：2006）中有關(guān)規(guī)定[3-5]，對(duì)HPLC法測(cè)定克拉霉素片含量的測(cè)量不確定度進(jìn)行了評(píng)估，以期找出影響不確定度的各種因素，為客觀評(píng)價(jià)克拉霉素片的檢驗(yàn)結(jié)果提供科學(xué)依據(jù)。

1 克拉霉素片的含量測(cè)定方法

1.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以磷酸鹽緩沖液（pH 5.5）-乙腈（600∶400）為流動(dòng)相；檢測(cè)波長為210 nm；柱溫45℃。理論板數(shù)按克拉霉素峰計(jì)算不低于3 000；拖尾因子不得過2.0；克拉霉素峰與相鄰雜質(zhì)峰的分離度符合要求。

1.2 對(duì)照品溶液的配制

精密稱取克拉霉素對(duì)照品（中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)130558-200902，純度97.9%）適量，置50 mL量瓶中，用流動(dòng)相溶解并定量稀釋制成每毫升中約含0.35 mg的溶液。

1.3 供試品溶液的配制

取本品10片（麗珠集團(tuán)麗珠制藥廠，0.25 g/片），精密稱定，研細(xì)，精密稱取細(xì)粉適量（約相當(dāng)于克拉霉素35 mg）置100 mL量瓶中，加流動(dòng)相充分振搖使溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

1.4 測(cè)定方法與數(shù)據(jù)分析

分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，記錄對(duì)照品溶液和供試品溶液的峰面積，按外標(biāo)法以色譜峰面積計(jì)算，即得[1]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果記錄見表1。

計(jì)算公式：X=〔（As×Wr×P×Vs×M） / （Ar×Vr×10×Ws×K標(biāo)）〕×100%。式中：

X：克拉霉素的標(biāo)示量（%）；

As：供試品溶液的峰面積；

Ar：對(duì)照品溶液的峰面積；

Wr：對(duì)照品稱樣量；

Ws：供試品稱樣量；

P：對(duì)照品的純度；

Vr：對(duì)照品稀釋倍數(shù)；

Vs：樣品稀釋倍數(shù)；

M：10片克拉霉素重量；

K標(biāo)：克拉霉素片劑的標(biāo)示量（0.25g）。

2 不確定度的量化分析

2.1 對(duì)照品引起的不確定度

2.1.1 對(duì)照品純度引起的相對(duì)不確定度 屬B類不確定度?？死顾貙?duì)照品由中國藥品生物制品檢定所提供，批號(hào)：130558-200902，純度97.9%，使用前無需干燥處理，未給出限度標(biāo)識(shí)，其相對(duì)不確定度可視為0。

2.1.2 對(duì)照品稱量引起的相對(duì)不確定度 電子分析天平校準(zhǔn)的不確定度分析：使用METTLER TOLEDO AG 285雙量程電子分析天平（d=0.01 mg），檢定證書列出的最大允差△為±0.03 mg，屬B類不確定度，按矩形分布，其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.03/31/2=0.017 3 mg。

電子分析天平稱量重復(fù)性的不確定度分析：使用的電子分析天平（d=0.01 mg），檢定證書列出的重復(fù)性誤差為±0.05 mg，屬B類不確定度，按矩形分布，其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.05/31/2=0.028 9 mg；單次稱量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：（0.017 32+0.028 92）1/2=0.033 7 mg，因?yàn)榉Q量過程使用的是減重法，其不確定度為：（2×0.033 72）1/2=0.047 7 mg。

對(duì)照品雙樣稱量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為：0.047 7/18.45=2.59×10-3和0.074 8/16.86=2.83×10-3，故對(duì)照品稱量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為： [（2.59×10-3）2+（2.83×10-3）2]1/2=3.83×10-3。

表1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果記錄表

2.1.3 對(duì)照品稀釋引起的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度 查閱《常用玻璃量器檢定規(guī)程》JJG196-2006[6]，A級(jí)50 mL規(guī)格容量瓶的體積允差△為±0.05mL，屬B類不確定度，按三角分布，其相對(duì)不確定度為：0.05/（61/2×50）=4.08×10-4。

容量瓶體積重復(fù)性不確定度：對(duì)50 mL容量瓶加水至刻度后稱量，重復(fù)10次操作，得出的標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.008 2 mL，屬A類不確定度，其相對(duì)不確定度為：0.082/50 =1.64 ×10-4。

溫差引起的不確定度：由玻璃儀器制造商提供的信息，50 mL容量瓶在20 ℃下校準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)室環(huán)境實(shí)測(cè)溫度為26 ℃，屬B類不確定度，按矩形分布，在95%置信概率下，其相對(duì)不確定度為：6×2.1×10-4×50/（31/2×50）=7.27×10-4。

對(duì)照品溶液稀釋引起的相對(duì)不確定度：[（4.08×10-4）2+（1.64×10-4）2+（7.27×10-4）2]1/2=8.50×10-4。

2.2 供試品引起的不確定度

2.2.1 供試品稱量引起的相對(duì)不確定度 電子分析天平校準(zhǔn)的不確定度分析：使用的電子分析天平（d=0.01 mg），檢定證書列出的最大允差△為±0.03 mg，屬B類不確定度，按矩形分布，其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.03/31/2=0.017 3 mg。

電子分析天平稱量重復(fù)性的不確定度分析：使用的電子分析天平（d=0.01 mg），檢定證書列出的重復(fù)性誤差為±0.05 mg，屬B類不確定度，按矩形分布，其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.05/31/2=0.028 9mg。單次稱量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：（0.017 32+0.028 92）1/2=0.033 7 mg，因?yàn)榉Q量使用的是減重法，其不確定度為：（2×0.033 72）1/2=0.047 7 mg。

供試品雙樣稱量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為0.047 7/63.70=7.49×10-4和0.047 7/63.50=7.51×10-4，故供試品稱量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：[（7.49×10-4）2+（7.51×10-4）2]1/2=1.06×10-3。

2.2.2 供試品稀釋引起的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度 查閱《常用玻璃量器檢定規(guī)程》JJG196-2006[6]，A級(jí)100 mL規(guī)格容量瓶的體積允差△為±0.10 mL，屬B類不確定度，按三角分布，其相對(duì)不確定度為：0.10/（61/2×100）=8.16×10-4。

容量瓶體積重復(fù)性不確定度：對(duì)100 mL容量瓶加水至刻度后稱量，重復(fù)10次操作，得出的標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.015 mL。屬A類不確定度，其相對(duì)不確定度為：0.015/100=1.50×10-4。

溫差引起的不確定度：由玻璃儀器制造商提供的信息，100 mL容量瓶在20℃下校準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)室環(huán)境實(shí)測(cè)溫度為26℃，屬B類不確定度，按矩形分布，在95%置信概率下，其相對(duì)不確定度為：（6×2.1×10-4×100）/（31/2×100）=7.27×10-4。

供試品溶液稀釋引起的相對(duì)不確定度：[（8.16×10-4）2+（1.50×10-4）2+（7.27×10-4）2]1/2=1.10×10-3。

2.3 對(duì)照品溶液進(jìn)樣重現(xiàn)性的不確定度

精密稱取2份克拉霉素對(duì)照品，分別配成對(duì)照品溶液，每份溶液重復(fù)進(jìn)樣3次，得到6個(gè)色譜峰面積數(shù)據(jù)，屬A類不確定度，為隨機(jī)測(cè)量，結(jié)果見表1。雙份對(duì)照品溶液各自的相對(duì)不確定度分別為 1.5/368.7=3.95×10-3和 1.2/333.6=3.58×10-3，故對(duì)照品溶液進(jìn)樣的相對(duì)不確定度為[（3.95×10-3）2+（3.58×10-3）2]1/2=5.33×10-3。

2.4 供試品溶液進(jìn)樣重現(xiàn)性的不確定度

精密稱取2份克拉霉素片供試品，分別配制成供試品溶液，每份溶液重復(fù)進(jìn)樣2次，得到4個(gè)色譜峰面積數(shù)據(jù)，結(jié)果用極差法計(jì)算，取n=2時(shí)極差系數(shù)C=1.13，記錄雙樣測(cè)量峰面積為：356.7、358.5；351.3、350.8；則：S1=（356.7+358.5）/2=357.6，r=1.8；S2=（351.3+350.8）/2=351.1，r=0.5。

則相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：{[1.8/（1.13×357.6）]2+[0.5/（1.13×351.1）2]}1/2=4.63×10-3。

2.5 平均片重稱量引入的不確定度

電子分析天平校準(zhǔn)的不確定度分析：使用的電子分析天平（d=0.01 mg），檢定證書列出的最大允差△為±0.03 mg，屬B類不確定度，按矩形分布，其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.03/31/2=0.017 3 mg。

電子分析天平稱量重復(fù)性的不確定度分析：使用的電子分析天平（d=0.01 mg），檢定證書列出的重復(fù)性誤差為±0.05 mg，屬B類不確定度，按矩形分布，其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.05/31/2=0.028 9 mg。單次稱量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度：（0.017 32+0.028 92）1/2=0.033 7 mg，因?yàn)榉Q量過程使用的是減重法，其不確定度為：（2×0.033 72）1/2=0.047 7 mg。

供試品平均片重稱量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.047 7/456.3=1.05×10-4。

2.6 不確定度各分量及分析

不確定度各分量及分析結(jié)果見表2。

表2 不確定度各分量的分析結(jié)果

2.7 合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：[（3.83×10-3）2+（8.50×10-4）2+（5.33×10-3）2+（1.06×10-3）2+（1.05×10-4）2+（1.10×10-3）2+（4.63×10-3）2]1/2=8.22×10-3。

合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：8.22×10-3×100.1%=0.82%。

2.8 擴(kuò)展不確定度

取包含因子k=2，則擴(kuò)展不確定度為：2×0.82% =1.6%。

則克拉霉素片含量測(cè)定結(jié)果可表示為： 100.1%±1.6%， k=2。

3 討論

不確定度的評(píng)定是一份完整的藥品檢驗(yàn)報(bào)告書應(yīng)包括的內(nèi)容，任何檢驗(yàn)方法都不可避免地會(huì)引入不確定度。不確定度對(duì)檢測(cè)結(jié)果臨界值的判斷和檢驗(yàn)方法的確認(rèn)等具有十分重要的意義。由上述不確定度的分析評(píng)定結(jié)果可知，HPLC法測(cè)定克拉霉素片含量的不確定度主要來自液相色譜儀的進(jìn)樣、對(duì)照品的稱量和供試品溶液的配制等環(huán)節(jié)，其中由對(duì)照品溶液和供試品溶液色譜分析進(jìn)樣環(huán)節(jié)的不確定度之和占不確定度總和的60%，提示在采用HPLC法測(cè)定克拉霉素片的含量時(shí)，應(yīng)確保液相色譜儀的技術(shù)性能指標(biāo)與被測(cè)藥品的有關(guān)參數(shù)要求相適應(yīng)，定期做好液相色譜儀的計(jì)量檢定和期間核查工作，使其始終處于良好穩(wěn)定的工作狀態(tài)；同時(shí)要嚴(yán)格按照藥典標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的要求取樣，選用精度符合要求的分析天平稱量，不能只為節(jié)約檢驗(yàn)成本和操作方便而隨意減少對(duì)照品和供試品的取樣量，盡可能減少操作的隨意性和人為因素對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果造成的不利的影響。

[1]國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典（二部）[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：153.

[2]陳新謙，金有豫，湯光.新編藥物學(xué)（第15版）[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2003：89.

[3]JJF1135-2005.化學(xué)分析測(cè)量不確定度評(píng)定[S].北京：中國計(jì)量出版社，2005.

[4]JJFl059-1999.測(cè)量不確定度評(píng)定與表示[S].北京：中國計(jì)量出版社，1999.

[5]CNAS-GL06.化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南[S].北京：中國計(jì)量出版社，2006.

[6]JJG196-2006.常用玻璃量器檢定規(guī)程[S].北京：中國計(jì)量出版社，2006.