方 文,肖靚靚,包懷恩,牟 榮

2.貴陽醫(yī)學院寄生蟲學教研室,貴陽 550004

豬帶絳蟲病是在世界范圍內流行、危害人類健康的腸道蠕蟲病之一,而其幼蟲除了可寄生于中間宿主豬外,還可寄生于人體,引起嚴重的囊尾蚴病[1],不僅給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大經濟損失,而且給人民健康帶來嚴重威脅。因此積極開展對豬帶絳蟲的研究并控制其感染和流行具有重要意義。谷胱甘肽S-轉移酶(glutathione S-transferase,GST)廣泛存在于多種生物體內,對機體具有重要的解毒和保護作用。迄今為止,在所有已研究過的蠕蟲中均證實有GST表達,并證實GST在蠕蟲抵抗宿主免疫攻擊中起重要作用[2]。本研究應用免疫組化、雙向電泳結合蛋白質印跡技術分析豬囊尾蚴GST的表達,為篩選豬帶絳蟲保護性抗原及可能的治療靶分子提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 GST免疫組化試劑盒(北京中杉生物技術有限公司)、固相pH梯度(immobilized pH gradient,IPG)干膠條(pH 3～10,7 cm)、IPG 緩沖液(pH 3～10)、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、甘氨酸、三羥甲基氨基甲烷(T ris)、二硫蘇糖醇(DTT)、硫脲(Thioourea)、十二烷基硫酸納(SDS),超純脲(ultra urea)、四甲基乙二胺(T EMED)、丙基硫酸鹽(CHAPS)、碘乙酰胺(iodoacetamide)、蛋白酶抑制劑(Protease Inhibitor Cocktail)、核酸酶(Dnase和Rnase)等(美國General Electric公司),低分子量蛋白標準(北京天根生化科技有限公司),辣根過氧化物酶標記的羊抗大鼠IgG(HRP-IgG)(北京索來寶生物技術有限公司),聚偏氟乙烯膜(PVDF膜)及化學發(fā)光(ECL)試劑盒(武漢博士德生物技術有限公司),其余試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 實驗蟲體的來源及蟲卵懸液的制備 豬帶絳蟲成蟲,采自四川省雅江縣呷拉鄉(xiāng)豬帶絳蟲病患者(女性,28歲,自訴經常肚子痛,有排節(jié)片史,喜食生臘肉),口服檳榔-南瓜子驅蟲[3],新鮮蟲體用0.9%生理鹽水浸泡保存。蟲體孕節(jié)及頭節(jié)用卡紅染色,制作壓片,經顯微鏡觀察證實為豬帶絳蟲成蟲。挑開豬帶絳蟲后段全部孕節(jié)的子宮,用生理鹽水沖洗子宮數(shù)次使蟲卵溢出,收集全部沖洗液,3 000 r/min離心15 min,收集沉淀的蟲卵。取蟲卵懸液1mL進行膽汁孵育試驗,用臺盼藍染色計數(shù)六鉤蚴法[4]檢測蟲卵存活率為 80%。取蟲卵懸液0.1mL,光鏡下計數(shù)蟲卵(重復操作6次,取平均值),計算蟲卵總數(shù)。用生理鹽水稀釋蟲卵懸液濃度約10萬個/mL,其中的存活蟲卵數(shù)約為8萬個/mL(10萬×80%)。

1.2.2 實驗動物感染 20d齡三元雜交乳豬6頭,體重6.5～7kg,由貴州大學農學院動物養(yǎng)殖中心提供,經糞檢和間接血凝實驗(IHA)證實,無豬囊尾蚴及其他寄生蟲感染。將每頭豬灌胃1mL蟲卵(8萬個/mL)。乳豬以專用膨化顆粒飼料飼養(yǎng),隔離圈養(yǎng)于清潔水泥地面飼養(yǎng)宅內,防止自然感染。

1.2.3 免疫組化 在第40d、80d和120d天各宰殺2頭豬。取含豬囊尾蚴的肝臟(120 d除外)和肌肉組織1.0×1.0×0.5cm3各數(shù)塊,置于10%福爾馬林中4℃冰箱過夜。常規(guī)脫水,石蠟包埋,4μ m 連續(xù)切片。切片經脫蠟、脫苯、水化后,置于 pH 6.0枸櫞酸緩沖液中用高壓鍋進行抗原修復2min,PBS洗滌3次,分別滴加單克隆抗體GST(1∶300),置于4℃冰箱內過夜,PBS洗滌后滴加二抗孵育30min,然后常規(guī)DAB顯色、蘇木素復染、封片。陰性對照用PBS液代替一抗。

1.2.4 數(shù)據(jù)測量及顯微攝影 將上述免疫組化切片每組隨機選取10張,每張切片在囊尾蚴囊壁及頭節(jié)隨機選取5個視場,每個視場選取5個陽性表達區(qū)域用Mias圖像分析處理系統(tǒng)測量平均光密度(平均光密度為測量薄層斑點透射光強度大小,平均光密度值越大,標本染色越淺)。日本NIKON光學顯微攝影裝置拍照。

1.2.6 豬囊尾蚴蛋白的制備 取感染后40d寄生在肌肉的豬囊尾蚴50 mg,用1 mL裂解液[含7 mol/L超純脲(ultraurea),2 mol/L硫脲(Thiourea),4%丙基硫酸鹽(CHAPS),40 mmol/L二硫蘇糖醇(DT T),2%pH 3～10固相pH 梯度(IPG)緩沖液],臨用前加1%復合蛋白酶抑制劑(Protease Inhibitor Mix)冰浴勻漿,分裝于1.5 mL離心管,加20μ g/mL脫氧核糖核酸酶(Dnase)和 5μ g/mL核糖核酸酶(RNase)置4℃15 min,于4℃40 000×g離心1 h,收集上清,用雙向電泳沉淀劑(2D cleanup)試劑盒處理?？捡R斯亮藍法(Bradford法)測定蛋白濃度,分裝,-80℃保存。

1.2.7 豬囊尾蚴蛋白雙向電泳分析 豬囊尾蚴總蛋白溶液于4℃融化、8 000×g離心10 min。加入上樣緩沖液(7mol/L ultraurea、2 mol/L T hiourea、2%CHAPS、65mmol/L DTT、0.5%pH 3 ～ 10 IPG緩沖液和痕量溴酚藍),每膠條上樣300μ g(體積為 125μ L),將兩根 IPG膠條(7cm)分別置于溶脹槽中重泡脹至少12 h,再轉入等電聚焦儀(型號為Ettan IPGphorⅢ ,美國 General Electric公司)進行第一向等電聚焦(依次為250 V 40 min,500 V 40 min,4000 V 3 h,4000 V 20000 Vh)。膠條經兩次平衡后進行12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),其中的一塊膠為制備膠,另一塊膠用于蛋白質印跡(Western blotting)分析。制備膠經考馬斯亮藍染色,用掃描儀(型號為UNISCAN e100,中國清華紫光股份有限公司)進行透射掃描,用雙向電泳圖像分析軟件(ImageMaster 2D platinum 5.0)對圖像進行強度校正、點檢測、背景消減和點匹配等。用二維校正法確定蛋白質等電點(pI)和相對分子質量(Mr)。實驗重復3次。

1.2.8 蛋白質印跡(Western-blotting)分析 采用半干轉膜技術(參照TE77 PWR半干轉儀器說明書)將雙向電泳凝膠蛋白轉至PVDF膜(與凝膠同樣大小)(1.0 mA/cm2室溫轉移1.0 h)。用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h,TBST(含20 mmol/L Tris·HCl pH 7.6,140 mmol/L NaCl和0.1%Tween20)洗3次(10 min/次,下同)。實驗組一抗為本課題組自制大鼠抗豬帶絳蟲GST血清[5](1∶100)、對照組一抗為正常大鼠血清(1∶100)室溫孵育3 h,TBST洗膜3次。二抗為羊抗大鼠HRP-IgG(1∶200)室溫孵育2 h,TBST洗膜 3次。干燥1～2 min。在暗室將膠片剪成與PVDF膜同樣大小,用化學發(fā)光(ECL)試劑盒(產品編號:EK1004,中國武漢博士德生物工程有限公司)將PVDF膜進行膠片曝光顯影、定影,流水沖洗、干燥,掃描保存雜交圖像。比較兩組雜交蛋白點的差異,確定豬囊尾蚴GST抗原抗體陽性雜交斑點。

2 結 果

2.1 免疫組化觀察 GST陽性表達主要定位于豬囊尾蚴頭節(jié)及囊壁細胞的胞漿,呈棕黃色顆粒,見圖1。不同時期寄生在肝臟及肌肉的豬囊尾蚴均表達GST,隨感染時間增加,寄生在肌肉的豬囊尾蚴GST的表達變化不大(P＞0.05),寄生在肝臟的豬囊尾蚴GST的表達升高(P ＜0.05),見表1。

圖1 豬囊尾蚴GST的表達1.1陰性對照(感染40d寄生在肌肉的豬囊尾蚴頭節(jié)及囊壁胞漿處未見GST棕黃色顆粒)(×100);1.2感染80d的豬囊尾蚴囊壁及鄰近肌肉組織胞漿處可見GST棕黃色顆粒(×200);1.3感染120d寄生在肌肉的豬囊尾蚴頭節(jié)胞漿處可見GST棕黃色顆粒(×100);1.4感染40d的豬囊尾蚴囊壁及鄰近肝組織胞漿處可見GST棕黃色顆粒(×200);1.5感染80d的豬囊尾蚴囊壁及鄰近肝組織胞漿處可見GST棕黃色顆粒(×200)Fig.1 GST expression on cysticercus cellulosae1.1 Negative control(None GST brown granules could be seen in cysticercus cellulosae parasitizedin muscle 40 days after infection)(×100);1.2 GST brown granules could be seen in cysticercus cellulosae and the adjacent muscle 80 days after infection(×200)1.3 GST brown granules could be seen in the head of cysticercus cellulosae parasitizedin muscle 120 days after infection(×100);1.4 GST brown granules could be seen in cysticercus cellulosae and the adjacent liver 40 days after infection(×200);1.5 GST brown granules could be seen in cysticercus cellulosae and the adjacent liver 80 days after infection(×200)

2.2 豬囊尾蚴蛋白雙向電泳 3塊制備膠經考馬斯亮藍染色后用掃描儀獲取圖像,再用雙向電泳圖像分析軟件進行分析,結果表明蛋白斑點數(shù)為207±9,相對分子質量(Mr)為 14 400～94 000,等電點(pI)為3.0～10.0。其中153±4個蛋白斑點的 pI為4.0～7.0,在極酸性(pH 3)和極堿性(pH 10)區(qū)域也出現(xiàn)少量蛋白斑點,見圖2。

2.3 豬囊尾蚴GST的Western-blotting分析 結果顯示,豬囊尾蚴GST抗原抗體陽性雜交斑點為1個,陰性對照未見抗原抗體陽性雜交斑點,見圖3。將Western-blotting檢測的抗原抗體陽性雜交斑點與原雙向電泳凝膠斑點進行比對,找到對應蛋白斑點,經ImageMaster 2D Platinum 5.0軟件分析后初步確定該蛋白斑點的pI/Mr為(6.6/25 548),與豬帶絳蟲GST的pI/Mr理論推導值接近。

表1 不同時期和寄生部位豬囊尾蚴GST表達的平均光密度值( ±s)Table 1 GST average value of optical densityon cysticercuscellulosae parasited in different tissuesat different times

表1 不同時期和寄生部位豬囊尾蚴GST表達的平均光密度值( ±s)Table 1 GST average value of optical densityon cysticercuscellulosae parasited in different tissuesat different times

*:表示和同組40d比較,P＜0.05.

部位 40d 80d 120d肝臟 179.84±6.59 171.73±6.82* 0對照組 198.54±5.82 201.46±2.19 0肌肉 183.22±7.11 181.95±6.36 184.12±5.47對照組 201.43±1.59 201.54±4.21 201.83±2.35

3 討 論

谷胱甘肽S-轉移酶(glutathione S-ransferases,GST)從原蟲到脊椎動物廣泛存在,是由多個基因編碼、具有多種功能的超家族酶。它能使外源性或內源性的毒素分子失活而轉變?yōu)樗苄曰衔镆赃_到初步解毒的作用,因而是多種生物體內主要的Ⅱ相解毒系統(tǒng),與許多生理及異源物質的排泄有關[6-7]。

Brophy等[2]報道在所有蠕蟲成蟲的體內均存在有活性的GST,且GST多存在于蟲體細胞的胞質中,是蠕蟲主要解毒酶之一。方強[8]等用GST底物催化法檢測寄生在肌肉的成熟、未成熟豬囊尾蚴頭節(jié)及囊壁勻漿的GST活性,發(fā)現(xiàn)豬囊尾蚴頭節(jié)及囊壁內存在相同的GST活性,且GST活性與豬囊尾蚴的成熟程度無關。

本研究結果顯示:不同時期寄生在肝臟及肌肉的豬囊尾蚴均表達GST,隨感染時間增加,寄生在肌肉的豬囊尾蚴GST的表達變化不大(P＞0.05),寄生在肝臟的豬囊尾蚴(120d除外)GST的表達升高(P＜0.05)。病理觀察肝臟炎癥反應也隨感染時間延長而加重,可能由于肝臟血供豐富,抗體較其他器官集中,宿主對囊尾蚴產生強烈的炎癥病理反應,可是早期豬囊尾蚴依然存活下來繼續(xù)生長,推測GST的表達在一定程度上對豬囊尾蚴在宿主中的生存起到保護作用,隨感染時間增加GST分泌增多,直到后期(120d)豬囊尾蚴才出現(xiàn)壞死和鈣化,推測是由于肝臟中宿主免疫效應逐漸增強,豬囊尾蚴自身保護機制與宿主免疫殺傷作用抗爭的結果。

本研究首次運用雙向電泳結合western-blotting技術分析豬囊尾蚴GST的表達。蛋白質雙向電泳技術應用于帶絳蟲的研究報道不多,僅見少量豬帶絳蟲蛋白質組的研究報道[9-11],本研究首次運用雙向電泳技術獲得豬囊尾蚴的總蛋白圖譜,并用本課題組自制的大鼠抗豬帶絳蟲GST血清[5]作蛋白質印跡反應,得到1個特異性抗原抗體陽性雜交斑點,陰性對照未見陽性雜交斑點。將 Western blotting檢測的抗原抗體陽性雜交斑點與原雙向電泳凝膠斑點比對后找到對應蛋白斑點,經 ImageMaster 2D Platinum 5.0軟件分析后初步確定該蛋白斑點的pI/Mr為6.5/25 548,與豬帶絳蟲GST的pI/Mr理論推導值接近[12]。

如今 ,GST作為較強保護性抗原、有效的降低機體蟲荷和排泄物蟲卵的數(shù)量及影響成蟲生殖能力的特點逐漸被學術界認同。同時,GST還是抗惡性瘧原蟲潛在的藥物靶標[13],也是免疫化學方法抗蠕蟲的潛在標靶,是WHO提出的6個最具有潛力的候選疫苗分子之一[14-15]。本研究揭示不同時期和寄生部位豬囊尾蚴GST的表達情況,這對開發(fā)相關疫苗及可能的治療靶分子,實現(xiàn)對寄生蟲數(shù)量和分布的控制會起到積極作用,從而為畜牧業(yè)生產及人類健康服務。

[1]吳觀凌.人體寄生蟲學[M].3版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2005:515-530.

[2]Brophy PM,Pritchard DI.Parasitic helminth glutathione S transferase[J].Exp Parasitol,1994,79(1):89-96.

[3]李雍龍.人體寄生蟲學[M].3版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2004:146.

[4]Wang IC,Ma YX,Kuo CH,et al.A comparative study on egg hatching methods and oncosphere viability determination for Taenia solium eggs[J].International Journal for Parasitology,1997,27(11):1311-1314.

[5]戴佳琳,黃江,廖興江,等.豬帶絳蟲谷胱甘肽轉移酶GST的原核表達及免疫學研究[J].中國人獸共患病學報,2010,26(2):107-110.

[6]聶立紅,王聲勇,胡毅玲.谷胱甘肽轉移酶研究進展[J].中國病理生理雜志,2000,16(11):1240-1243.

[7]姚欣,錢元恕.肝外藥物代謝酶的研究進展[J].國外醫(yī)學藥學分冊,2003,30(2):97-101.

[8]方強,閩宏林,夏惠,等.豬囊尾蚴谷胱甘肽-S-轉移酶活性研究[J].實用寄生蟲病雜志,2000,8(1),12-13.

[9]Mayta H,Hancock K,Levine MZ,et al.Characterization of a novel Taenia solium oncosphere antigen[J].Mol Biochem Parasitol,2007,156(2):154-161.

[10]Levine MZ,Calderón JC,Wilkins PP.Characterization,cloning and expression of two diagnostic antigens for Taenia solium tapeworminfection[J].J Parasitol,2004,90(3):631-638.

[11]方文,包懷恩,肖靚靚,等.豬囊尾蚴特異性抗原的篩選、鑒定和生物信息學分析[J].中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志,2009,27(4):313-317.

[12]黃江,胡旭初,徐勁,等.亞洲帶絳蟲成蟲谷胱甘肽S-轉移酶基因的克隆及生物信息學分析[J].中國人獸共患病學報,2007,23(11):1093-1100.

[13]Harwaldt P,Rahlfs S,Becker K.Glutathione S-transferase of the malarial parasite Plasmodium falaiparum:characterization of a potential drug target[J].Biol Chem,2002,383(5):821-830.

[14]Bergquist NR,Colley DG.Schistosomiasis vaccines:research to development[J].Parasitol Today,1998,14(3):99-104.

[15]Boulanger D,Warter A,Sellin B,et al.Vaccine potential of a recombinant glutathine S-transferase cloned from Schistosoma haematobiumin primates experimentally infected with an homologous challenge[J].Vaccine,1999,17(4):319-326.