趙麗麗，劉忠，張渝潔

Hath1 也稱作 ATOH1（atonal homolog 1），是一個(gè)堿性螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)（basic helix-loop-helix,bHLH）的轉(zhuǎn)錄因子。Hath1 基因與果蠅屬 atonal基因和鼠 Math1（mouse atonal homolog 1）基染色體同源，定位于人染色體 4q22，mRNA 長 1065 bp，編碼蛋白 38 kD[1]。結(jié)腸癌是常見的惡性腫瘤，發(fā)病率逐年上升，Hath1 基因能促進(jìn)腸分泌細(xì)胞包括杯狀細(xì)胞（goblet）的終末分化，并誘導(dǎo)黏蛋白 2（mucin 2）的表達(dá)[2]。在結(jié)腸癌發(fā)生的漸進(jìn)累積過程中，杯狀細(xì)胞逐漸減少甚至消失，黏蛋白也明顯減少[3]。在絕大多數(shù)結(jié)腸癌中 Wnt 信號一直處于活化狀態(tài)[4]，使得 Hath1 的表達(dá)受到抑制。而Hath1 基因的表達(dá)可以促進(jìn)結(jié)腸分泌細(xì)胞的分化，Hath1 基因表達(dá)的缺失限制了分泌型細(xì)胞的分化。因此嘗試在結(jié)腸癌中表達(dá) Hath1 基因，研究 Hath1在結(jié)腸癌中是否可以發(fā)揮腫瘤抑制基因的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 腫瘤細(xì)胞 HT-29、LS174T、SW480、SW620、IEC-6 購自上海生命科學(xué)院；Lipofectamine Reagent 轉(zhuǎn)染試劑盒購自美國 Invitrogen 公司；RT-PCR 試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司；MTS 購自美國 Promega 公司；trizol 購自上海生物工程公司；DNase I 購自大連寶生物公司；熒光染料超混合液購自美國 BioRad 公司；細(xì)胞 RNA抽提試劑盒購自上海華舜生物工程有限公司；pcDNA3.1(+) 大腸桿菌菌保（DH5 a）菌株由本公司保存。

1.1.2 儀器 FCAS440 流式細(xì)胞儀為美國 BD公司產(chǎn)品；Model 680 酶標(biāo)儀為美國 BioRad 公司產(chǎn)品；7700 型實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀為美國Applied Biosystems 公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 總 RNA 的提取 腫瘤細(xì)胞在 10cm 培養(yǎng)板中培養(yǎng)到 80%密度的時(shí)候，用 trizol 試劑提取細(xì)胞總 RNA。吸去細(xì)胞培養(yǎng)液，加入 3 ml trizol試劑，輕輕搖勻，室溫放置 5min 使細(xì)胞裂解完全，收集裂解液于離心管中，加 300 μl 氯仿劇烈搖勻，室溫放置 2min，4℃12 000×g離心 15min，取上層水相到另一離心管內(nèi)，加入 750 μl 異丙醇搖勻，室溫放置 10min，4℃12 000×g離心 10min，棄去上清，用 1 ml 焦碳酸二乙酯（DEPC）–75%乙醇洗滌沉淀，晾干，溶解于 100 μl DEPC 水中。加11.3 μl 10×DNase I （脫氧核糖核酸酶）緩沖液，2 μl DNase I，42℃處理 25min，用分光光度計(jì)定量 RNA 濃度。組織總 RNA 的提取，在超聲破碎組織后以同法用 trizol（總 RNA 抽提試劑）試劑提取。

1.2.2 定量逆轉(zhuǎn)錄 PCR 法測 Hath1 的表達(dá) 取3 μg 總 RNA 于 PCR 管中，加 3 μl random primer p(dN)6（隨機(jī)引物）80 ng/μl，1.5 μl 10mmol/L dNTPs，加雙蒸水至 16 μl，于 PCR 儀中 65℃加熱 5min，冷卻至 4℃，加 6 μl 5×First Strand Buffer（合成第一鏈緩沖液），3 μl 50mmol/L MgCl2，3 μl 0.1 mol/L 二硫蘇糖醇（DTT），2 μl RNaseOUT（重組核糖核酸酶抑制劑），4℃5min，25℃2min，加 80 UnitsmmLV（莫洛尼鼠白血病病毒）逆轉(zhuǎn)錄酶，25℃10min，42℃50min 進(jìn)行 cDNA 的第一鏈合成。75℃10min 失活逆轉(zhuǎn)錄酶，合成的cDNA 保存于 –20℃?zhèn)溆谩?/p>

取 2 μl cDNA，加 10 μl 熒光染料超混合液，0.6 μl 10 μmol/L 引物，加水至 20 μl，在定量 PCR儀上檢測基因的表達(dá)水平。以 beta-actin 基因作為對照。引物序列如下：

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 人腫瘤細(xì)胞 HT-29、LS174T、SW480、SW620 培養(yǎng)于 10%的胎牛血清的 RPMI 培養(yǎng)液中，在培養(yǎng) 48 h 后接種于6 孔板，按照 Lipofectamine 說明書進(jìn)行脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染。

1.2.4 MTS 法測細(xì)胞增殖率 細(xì)胞增殖率用MTS 法測定。腫瘤細(xì)胞 HT-29、LS174T、SW480、SW620 在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1 或者 pcDNA3.1-Hath1 24 h 后，以每孔 1000 個(gè)細(xì)胞鋪于 96 孔板內(nèi)，加 0.5%的血清于 37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h。在測定前 1 h 加 MTS 到細(xì)胞中。具體方法參考試劑盒說明書。

1.2.5 IEC-6 穩(wěn)定表達(dá) Hath1 siRNA 細(xì)胞系的構(gòu)建 RNA 干擾通過小發(fā)卡或短發(fā)卡 RNA（shRNA）實(shí)現(xiàn)。首先構(gòu)建載有 Hath1 特異性 shRNA 的表達(dá)質(zhì)粒載體 MSCV-LTRmiR30-PIG，將其轉(zhuǎn)染 LinX-1細(xì)胞包裝逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，48 h 后收集含有逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的細(xì)胞培養(yǎng)液，經(jīng) 0.45 μm 的濾膜除去細(xì)胞及碎片，病毒凍存于 –80℃?zhèn)溆谩?/p>

IEC-6 細(xì)胞以 200 μl 病毒液感染，感染的同時(shí)加 5 μg/ml 的聚凝胺（polybrene）提高病毒的感染效率。IEC-6 細(xì)胞以不含 shRNA 的病毒載體感染作為陰性對照。成功整合了病毒基因組的細(xì)胞會表達(dá)載體上的綠色熒光蛋白（GFP）。轉(zhuǎn)染了病毒的細(xì)胞用 2 μg/ml 的嘌呤霉素篩選 2 周。篩選后的具有藥物抗性的細(xì)胞采用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 和Western blot 方法分別從基因和蛋白質(zhì)水平評價(jià)shRNA 對 Hath1 基因的干擾效應(yīng)，并篩選出干擾效率最高的克隆。shRNA 的序列：AAACGACAAG AAGCTGTCCAAATAGTGAAGCCACAGATGTAT TTGGACAGCTTCTTGTCGTTG。

1.2.6 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡百分率 細(xì)胞處理后，收集懸浮細(xì)胞于離心管，連同貼壁細(xì)胞視情況用胰酶消化后制成單細(xì)胞懸液同懸浮細(xì)胞合并。（700～1000）×g離心 5min，用 PBS 漂洗，重復(fù)離心，漂洗。用 70%乙醇固定，4℃過夜。離心，棄固定液，PBS 洗兩次并重懸細(xì)胞。加100 μl RNase A（0.5 mg/ml）至總濃度為50 μg/ml，37℃30min。再加入 400 μl 碘化丙啶（PI）染色液（100 μg/ml PI，1%Triton X-100，0.9%NaCl）至總濃度為50 μg/ml，混勻，避光保存 30min。上機(jī)測試，記錄激發(fā)波長 488 nm。以標(biāo)準(zhǔn)程序用FACScan 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)亞二倍體凋亡峰，使用 Mac V1.01 版本的 Cellquest 和 Modfit LT軟件分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用 SPSS10.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩組間比較采用組成設(shè)計(jì)t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hath1 基因的表達(dá)

對 4株結(jié)腸癌細(xì)胞，一株大鼠小腸上皮細(xì)胞IEC-6 以及正常人小腸與結(jié)腸組織提取總 RNA，然后進(jìn)行定量 PCR（圖1）。

結(jié)果顯示：在正常人的小腸與結(jié)腸組織中有著比較高水平的 Hath1 的表達(dá)，結(jié)腸中的表達(dá)比小腸高。此外，在大鼠小腸上皮細(xì)胞 IEC-6 中也有著較多 Hath1 的表達(dá)。而在 4株結(jié)腸癌細(xì)胞中Hath1 的表達(dá)都很低，尤其在轉(zhuǎn)移瘤 SW480 細(xì)胞中幾乎無表達(dá)。這些結(jié)果表明 Hath1 基因在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)低于正常組織，可能起著腫瘤抑制基因的作用。

2.2 Hath1 基因?qū)Y(jié)腸癌細(xì)胞增殖的影響

結(jié)腸癌細(xì)胞中的 Hath1 表達(dá)很低或是幾乎無表達(dá)，為研究 Hath1 對結(jié)腸癌細(xì)胞的作用，在 4株結(jié)腸癌腫瘤細(xì)胞中過表達(dá)人的 Hath1 基因，通過MTS 法測定細(xì)胞的增殖率（圖2）。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在所有 4株結(jié)腸癌細(xì)胞中Hath1 的表達(dá)都顯著地抑制了腫瘤細(xì)胞的增殖。在SW480 細(xì)胞中，細(xì)胞增殖率被抑制了 38.5%；在HT29 中細(xì)胞生長被抑制了 23.4%；而在 LS174T細(xì)胞中抑制率達(dá)到 55%。結(jié)果證明 Hath1 基因抑制了結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖。

2.3 Hath1 基因的表達(dá)對結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的影響

為進(jìn)一步闡明 Hath1 抑制結(jié)腸癌腫瘤細(xì)胞生長的機(jī)制，研究 Hath1 對結(jié)腸癌細(xì)胞 LS174T 的凋亡誘導(dǎo)作用（圖3）。實(shí)驗(yàn)表明，LS174T 細(xì)胞過表達(dá) Hath1 與對照組相比并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。即Hath1 本身并不能有效地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，其腫瘤生長抑制作用不是通過凋亡誘導(dǎo)實(shí)現(xiàn)的。但是，過表達(dá) Hath1 的結(jié)腸癌細(xì)胞對化療藥物 5-FU引起的凋亡由對照組的 21.3%上升到 28.5%。即Hath1 的表達(dá)提高了腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性。

圖3 Hath1 基因?qū)Y(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的影響Figure 3 The effect of Hath1 gene on the colon cancer cell apoptosis

2.4 正常細(xì)胞中下調(diào) Hath1 的表達(dá)可提高細(xì)胞的生長率

在結(jié)腸癌細(xì)胞中的試驗(yàn)表明提高 Hath1 的表達(dá)抑制了結(jié)腸癌細(xì)胞的生長。圖1 結(jié)果顯示正常細(xì)胞中有著較高水平的 Hath1 表達(dá)。針對大鼠中的 Hath1 同源基因設(shè)計(jì)的 siRNA 干擾試驗(yàn)抑制大鼠 Hath1 同源基因的表達(dá)水平（圖4）。Hath1 基因被抑制的 IEC-6 細(xì)胞顯示出了顯著的細(xì)胞生長率的提高，從另一方面證明了 Hath1 起著腫瘤抑制基因的作用。

圖4 Hath1 siRNA對IEC-6細(xì)胞生長的影響Figure 4 The effect of Hath1 siRNA on the IEC-6 cell growth

3 討論

Hath1 基因作為一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，具有高度的同源性。Hath1 是 Ben-Arie 等[5]于 1996年克隆得到的果蠅 atonal 基因的同源基因。果蠅 atonal基因在果蠅神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育中起著關(guān)鍵的作用。Hath1 在小鼠中的同源基因 Math1 也在小鼠的消化系統(tǒng)的發(fā)育及分化過程中起著關(guān)鍵的作用。Math1缺失的轉(zhuǎn)基因小鼠在消化系統(tǒng)的發(fā)育中存在嚴(yán)重的缺陷。Math1 基因敲除的小鼠不能發(fā)育出所有三種小腸分泌型細(xì)胞[6]，其中包括 goblet 細(xì)胞，但是吸收細(xì)胞 enterocytes 不受影響。Math1 與細(xì)胞增殖的標(biāo)記 Ki-67 的共定位表明所有這些分泌型細(xì)胞都是來自一個(gè)表達(dá) Math1 的前體細(xì)胞，Math1在分泌型細(xì)胞的發(fā)育中起著關(guān)鍵性的作用。其他研究也表明 Math1 基因在背部神經(jīng)管的發(fā)育和細(xì)胞形態(tài)分化中有著重要的作用[7]。

所有這些研究都表明 Hath1 及其同源基因在個(gè)體的生長發(fā)育及多個(gè)組織的發(fā)生過程中起著重要的作用。其在小腸分泌型細(xì)胞的發(fā)生中起著的決定性作用已經(jīng)得到了比較充分的研究，而在組織發(fā)育與細(xì)胞分化之外的作用一直沒有得到很好的研究。在結(jié)腸癌發(fā)生的漸進(jìn)累積過程中，杯狀細(xì)胞逐漸減少[8]，在結(jié)腸癌中，杯狀細(xì)胞明顯減少甚至消失。除發(fā)病率較低的黏液腺癌和印戒細(xì)胞癌外，大多數(shù)結(jié)腸癌中的黏蛋白都明顯減少[9-10]，因此推測Hathl 基因與結(jié)腸癌的發(fā)病有關(guān)。

實(shí)驗(yàn)闡明了這一在正常組織中高表達(dá)而在腫瘤細(xì)胞中低表達(dá)的因子具有對結(jié)腸癌細(xì)胞顯著的腫瘤抑制作用。過表達(dá) Hath1 基因的結(jié)腸癌細(xì)胞都顯示出了顯著的生長抑制。在轉(zhuǎn)移性腫瘤 SW480中（38.5%）比原位性腫瘤 SW620 中（35.6%）的抑制作用略高。而在 LS174T 細(xì)胞中的抑制率達(dá)到了 55%。為此在 LS174T 細(xì)胞中進(jìn)一步研究了這一抑制作用是否通過細(xì)胞凋亡發(fā)生。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Hath1 在LS174T 中不能有效地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，但是可以顯著地提高腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性。這為臨床研究提供了一些有意義的參考。

[1]Hutcheson DA, Vetter ML.The bHLH factors Xath5 and XneuroD can upregulate the expression of XBrn3d, a POU-homeodomain transcription factor.Dev Biol, 2001, 232(2):327-338.

[2]Vetter ML, Brown NL.The role of basic helix-loop-helix genes in vertebrate retinogenesis.Semin Cell Dev Bio1, 2001, 12(6):491-498.

[3]Boland CR, Montgomery CK, Kim YS.Alterations in human colonic mucin occurring with cellular differentiation and malignant transformation.Proc Natl Acad Sci U S A, 1982, 79(6):2051-2055.

[4]Bienz M, Clevers H.Linking colorectal cancer to Wnt signaling.Cell,2000, 103(2):311-320.

[5]Ben-Arie N, McCall AE, Berkman S, et al.Evolutionary conservation of sequence and expression of the bHLH protein Atonal suggests a conserved role in neurogenesis.Hum Mol Genet, 1996,5(9):1207-1216.

[6]Yang Q, Bermingham NA, Finegold MJ, et al.Requirement of Math1 for secretory cell lineage commitment in the mouse intestine.Science,2001, 294(5549):2155-2158.

[7]Gowan K, Helms AW, Hunsaker TL, et al.Crossinhibitory activities of Ngn1 and Math1 allow specification of distinct dorsal interneurons.Neuron, 2001, 31(2):219-232 .

[8]Velcich A, Yang W, Heyer J, et al.Colorectal cancer in mice genetically deficient in the mucin Muc2.Science, 2002, 295(5560):1726-1729.

[9]Yang W, Velcich A, Lozonschi I, et al.Inactivation of p21 WAFI/cip1 enhances intestinal tumor formation in Muc2-/-mice.Am J Pathol,2005, 166(4):1239-1246.

[10]Akazawa C, Ishibashi M, Shimizu C, et al.A mammalian helix-loop-helix factor structurally related to the product of Drosophila proneural gene atonal is a positive transcriptional regulator expressed in the developing nervous system.J Biol Chem, 1995,270(15):8730-8738.