李薇，劉曉萍，徐祥，譚艷，于業(yè)軍，李艷君，任書亭，賈躍偉

為了進(jìn)一步研究 Ubc9 對(duì)細(xì)胞功能的影響，我們構(gòu)建帶有紅色熒光標(biāo)記（RFP）的含 Ubc9 基因的腺病毒載體，觀察 Ubc9 在 HeLa 細(xì)胞中的表達(dá)情況，為今后研究 Ubc9 的功能提供一個(gè)工具。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌株和主要生化試劑

穿梭質(zhì)粒 pAdTrack-TO4、腺病毒骨架質(zhì)粒pAdeasy-1、pCMV6-XL6-Ubc9 質(zhì)粒、大腸桿菌DH5a、BJ5183 及腺病毒包裝細(xì)胞 HEK293 細(xì)胞由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院外研所贈(zèng)予；轉(zhuǎn)染試劑PolyJetTM購自美國 SignaGen 公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒、膠回收試劑盒以及 DNA 標(biāo)記物購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；無內(nèi)毒素質(zhì)粒大量制備試劑盒購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司；DMEM 培養(yǎng)基、血清、胰蛋白酶購自美國 Gibco公司；限制性內(nèi)切酶、T4 DNA 連接酶購自大連Takara 公司；瓊脂糖及各種生化制劑由凌飛公司進(jìn)口分裝；PCR 引物由上海生工公司合成；基因測序由上海英濰捷基有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 PCR 法擴(kuò)增目的 Ubc9 基因 以 pcmv6-xl6-Ubc9 質(zhì)粒為模板進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。在引物中分別引入 BamH I 和 Xho I 的酶切位點(diǎn)，上游引物：5’ GGATCCATGTCGGGGATCGCCCTCAG 3’；下游引物：5’ TCCGCTCGAGTTATGAGGGCGCAAA CTTC 3’。PCR 反應(yīng)參數(shù)：94℃預(yù)變性 2min，94℃變性 30 s，60℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，循環(huán) 30 次，最后 72℃延伸 5min。PCR 產(chǎn)物經(jīng) 2%瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收獲得目的片段。

1.2.2 腺病毒穿梭質(zhì)粒 pAdTrack-CMV-Ubc9 的構(gòu)建 將 PCR 擴(kuò)增的 Ubc9 基因產(chǎn)物和帶有RFP 的穿梭質(zhì)粒 pAdTrack-CMV 分別以 BamH I和 Xho I 進(jìn)行雙酶切，經(jīng) 2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定并純化回收 Ubc9 片段及 pAdTrack-CMV 穿梭質(zhì)粒。用 T4 DNA 連接酶過夜連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5a。挑選轉(zhuǎn)化菌落，小量快速提取重組質(zhì)粒。通過限制性酶切和測序分析進(jìn)行鑒定。同時(shí)，以不含目的基因 Ubc9 的穿梭質(zhì)粒 pAdTrack-CMV 作為載體對(duì)照。

1.2.3 含有 pAdEasy-1 的 BJ5183 菌的制備 挑取單一克隆 BJ5183 菌接種在含 LB 培養(yǎng)基搖瓶中，37℃，200 r/min，培養(yǎng) 16 h。取 200 μl 菌液加入 20 ml 新鮮的 LB 培養(yǎng)基，37℃，260 r/min，培養(yǎng) 2 h，直至 OD 值為0.4～0.5。取 1.5 ml 菌液置 1.5 ml 離心管中，冰上放置 10min。4℃，3000×g離心 10min，棄上清。

加入 1 ml 0.1 mol/L 的 CaCl2輕輕吹打，充分懸浮，冰浴 10min。4℃，3000×g離心 10min，棄上清。加 1 ml 0.1 mol/L 的 CaCl2重懸沉淀，冰浴 30min。4℃，3000×g離心 10min，棄上清。用 100 μl 0.1 mol/L 的 CaCl2重懸沉淀，即感受態(tài)制備完成。

在感受態(tài)細(xì)胞中，加入 5 μl pAdEasy-1 質(zhì)粒，冰浴 30min。42℃熱刺激 90 s。冰浴 5min。加LB 培養(yǎng)基 900 μl，37℃，200 r/min 培養(yǎng) 30min后 3000×g離心 3min。收集沉淀并留 100 μl 上清，棄多余部分，混勻，涂布到含氨芐青霉素的 LB板。37℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)，約 16 h。挑取單個(gè)菌落，擴(kuò)增培養(yǎng)，獲取含有腺病毒骨架質(zhì)粒 pAdEasy-1的 BJ5183 感受態(tài)細(xì)菌，儲(chǔ)存待用。

1.2.4 pAdEasy-1/Ubc9 腺病毒載體的構(gòu)建 取1 μg pAdTrack-CMV-Ubc9 質(zhì)粒 DNA，PmeI 酶切線性化，乙醇沉淀回收后，轉(zhuǎn)化至含有腺病毒骨架質(zhì)粒 pAdEasy-1 的 BJ5183 感受態(tài)細(xì)菌中，混勻，冰上靜置 30min。42℃熱刺激 90 s，冰浴5min，加 LB 培養(yǎng)基 900 μl，37℃，200 r/min 培養(yǎng) 20min。接種于含有卡那霉素的平板上，孵育16 h。挑取較小的 10 個(gè)克隆擴(kuò)增培養(yǎng)，提取質(zhì)粒。用 PacI 酶切鑒定質(zhì)粒，將鑒定正確的重組質(zhì)粒再次轉(zhuǎn)化感受態(tài) DH5a 菌。擴(kuò)增培養(yǎng)，大量提取pAdEasy-1/ Ubc9 的重組腺病毒質(zhì)粒。并用 PacI酶切使之線性化，保存于 –20℃待用。

1.2.5 重組腺病毒的包裝及擴(kuò)增 于轉(zhuǎn)染前 12～18 h 鋪 293 細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá) 50%～70%時(shí)。采用脂質(zhì)體法將 5 μg 線性化的重組質(zhì)粒 pAdEasy-1/Ubc9 轉(zhuǎn)染至 293 細(xì)胞中，12 h 后換新鮮培養(yǎng)基（具體操作參照 PolyJetTM說明進(jìn)行轉(zhuǎn)染，同時(shí)轉(zhuǎn)染空載體作對(duì)照）。37℃5%CO2培養(yǎng) 5～7 d，待細(xì)胞出現(xiàn)病變時(shí)（7～10 d）收集細(xì)胞。于 –70℃和37℃水浴中反復(fù)凍融 4 次，3000×g離心 10min，收集上清。上清液中含原始重組腺病毒（Ad-Ubc9）。取重組病毒液重復(fù)感染 293 細(xì)胞 2～3 次，以大量擴(kuò)增病毒。分裝病毒液，保存于 –70℃。

2016年8月，游成令的女兒患上“急性普通B淋巴細(xì)胞L1型白血病”。這突如其來的噩耗，給這對(duì)農(nóng)村走出來的夫妻帶來了巨大的精神和經(jīng)濟(jì)壓力。游成令后悔以前沒有多關(guān)心女兒一點(diǎn)。在工作和家庭之間，她從來都是把工作放在第一位。

1.2.6 重組腺病毒感染 HeLa 細(xì)胞 取 HeLa細(xì)胞鋪于 6cm 平皿中，密度為106個(gè)/ml。貼壁后吸棄培養(yǎng)液，用滅菌 PBS 洗 2～3 遍。加入含Ad-Ubc9 病毒液感染 HeLa 細(xì)胞。培養(yǎng) 2 h 后棄病毒液，PBS 洗 3 遍，加入含 0.5%小牛血清的DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng) 72 h。

1.2.7 Western blot 檢測重組腺病毒蛋白的表達(dá) 感染 3 d 后收集細(xì)胞，提取總細(xì)胞蛋白（RIPA法）。取 10 μg 蛋白，用 12%SDS-PAGE 分離。PVDF 膜在轉(zhuǎn)印液中平衡 10min，然后遵循膠在負(fù)極，膜在正極的原則進(jìn)行轉(zhuǎn)印，電壓 90 V，4℃，2 h；取出 PVDF 膜用麗春紅染液染色，約 5min，蛋白條帶出現(xiàn)后，用去離子水漂洗；將 PVDF 膜置于 100 g/L 脫脂奶粉溶液中，封閉 2 h，兔抗Ubc9 血清（1∶1000），4℃過夜，TPBS 洗滌 3 次，10min/次；二抗?jié)舛葹?∶10000，室溫孵育1 h，TPBS 洗滌 3 次，10min/次。ECL Kit 檢測結(jié)果（同時(shí)用未感染病毒的 HeLa 細(xì)胞作對(duì)照）。

2 結(jié)果

2.1 目的片段（Ubc9）的擴(kuò)增

以 pcmv6-xl6-Ubc9 質(zhì)粒為模板，PCR 擴(kuò)增出477 bp 的 Ubc9 片段。產(chǎn)物經(jīng) 2%瓊脂糖凝膠電泳可觀察到約 477 bp 的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符（圖1）。

圖1 含 Ubc9 基因質(zhì)粒 PCR 擴(kuò)增結(jié)果Figure 1 Amplification of Ubc9 gene by PCR

2.2 酶切鑒定重組穿梭質(zhì)粒 pAdTrack-CMV-Ubc9

BamH I 和 Xho I 雙酶切產(chǎn)物電泳可觀察到約 9 kb 和 477 bp 的 DNA 條帶，經(jīng)過堿基測序，Ubc9基因未見突變，表明含有Ubc9基因的穿梭載體構(gòu)建成功，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)（圖2）。

圖2 瓊脂糖凝膠電泳鑒定穿梭質(zhì)粒 pAdTrack-CMV-Ubc9的酶切結(jié)果Figure 2 Restriction enzyme digestion analysis of shuttle plasmid pAdTrack-CMV-Ubc9 vectors

2.3 酶切鑒定重組質(zhì)粒 pAdEasy-1/Ubc9

pAdEasy-1/Ubc9 質(zhì)粒經(jīng) Pac I，酶切后獲得大小兩個(gè)片段，即 1 個(gè)大約 30 kb 和 1 個(gè) 4.5 kb的片段，表明穿梭質(zhì)粒 pAdTrack-CMV-Ubc9 與腺病毒骨架質(zhì)粒 pAdEasy-1 同源重組成功（圖3）。

圖3 瓊脂糖凝膠電泳鑒定 pAdEasy-1/Ubc9 的酶切結(jié)果Figure 3 Identification of recombinant adenovims vector by restriction enzyme digestion

2.4 重組腺病毒 Ad-Ubc9 的包裝

將帶有紅色熒光標(biāo)記的線性化 pAdEasy-1/Ubc9 轉(zhuǎn)染 293 細(xì)胞后，在熒光顯微鏡下，Ad-Ubc9 成功包裝細(xì)胞呈現(xiàn) RFP 陽性（圖4）。

圖4 轉(zhuǎn)染 293 細(xì)胞后 RFP 的表達(dá)Figure 4 RFP expression after plasmid transfected HEK293 cells

2.5 Ubc9 基因在靶細(xì)胞中的表達(dá)

Western blot 檢測可見感染重組腺病毒 Ad-Ubc9 的 HeLa 細(xì)胞中呈現(xiàn) Ubc9 蛋白高表達(dá)（圖5）。

圖5 Ubc9 在 HeLa 細(xì)胞中表達(dá)Figure 5 Analysis Ubc9 expression in HeLa cells by western blot

3 討論

SUMO 的生化反應(yīng)過程是一系列獨(dú)特的活化酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)過程，最終使其與底物蛋白結(jié)合完成蛋白質(zhì)修飾，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞活動(dòng)。自 SUMO 發(fā)現(xiàn)的十多年來，大量研究集中在酶反應(yīng)體系和蛋白質(zhì)相互作用方面，而 SUMO 修飾的功能學(xué)研究甚少。Ubc9 作為唯一的 E2 酶，SUMO 化修飾的完成依賴于 Ubc9 的表達(dá)，近年來對(duì) Ubc9 的研究成為熱點(diǎn)。有報(bào)道 Ubc9 基因的敲除可導(dǎo)致雞細(xì)胞的雙核細(xì)胞數(shù)量增加和鼠類細(xì)胞的細(xì)胞核形態(tài)異常以及染色體的缺失[9-10]。在果蠅細(xì)胞中，Ubc9 功能的缺失引起造血細(xì)胞的有絲分裂紊亂[11]。酵母菌中Ubc9 基因突變，會(huì)使其對(duì)引起 DNA 損傷的因素更加敏感[12-13]。為了更廣泛地研究 Ubc9在細(xì)胞中的功能，我們構(gòu)建表達(dá) Ubc9 的腺病毒表達(dá)載體。

重組腺病毒是復(fù)制缺陷型的腺病毒載體，也是目前基因治療研究和臨床試驗(yàn)中應(yīng)用最廣泛的病毒載體。傳統(tǒng)上，雙載體（即穿梭質(zhì)粒和骨架質(zhì)粒）同源重組過程是在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中來實(shí)現(xiàn)的。然而，由于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中同源重組的低效性以及某種程度上的不可預(yù)見性，使得該過程成為重組腺病毒制備的限速步驟。與傳統(tǒng)方法不同的是，該試驗(yàn)中兩種質(zhì)粒的重組是在細(xì)菌（BJ5183）中而非真核細(xì)胞中完成。由于質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌的效率極高，細(xì)菌繁殖速度快，且 BJ5183 菌中的 Rec A 可表達(dá)很強(qiáng)的重組酶活性，因此，細(xì)菌中同源重組法克服了細(xì)胞內(nèi)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染效率低和同源重組率低的缺點(diǎn)，大大縮短了實(shí)驗(yàn)周期，且顯著提高了成功率。另外，這種重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物包裝細(xì)胞株后，在共轉(zhuǎn)染的基因編碼的紅色熒光（RFP）的指示下，陽性轉(zhuǎn)染重組病毒的細(xì)胞容易被觀察和追蹤。該系統(tǒng)加快了各種目的重組腺病毒的制備和鑒定過程。

本實(shí)驗(yàn)通過限制性酶切分析及堿基序列測定，均證明已正確構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒 pAdTrack-CMVUbc9。在 HEK293 細(xì)胞中成功包裝重組腺病毒Ad-Ubc9。本研究所產(chǎn)生的重組腺病毒 Ad-Ubc9能在體外感染 HeLa 細(xì)胞，并成功表達(dá)出 Ubc9 蛋白，為進(jìn)一步研究 Ubc9 基因在細(xì)胞中的功能奠定了基礎(chǔ)。

[1]Li XD, Yang S, Qiu YF, et al.SUMOylation: an important post-translational modification in vivo.Chin J Cell Biol, 2008, 30:142-146.

[2]Sternsdorf T, Jensen K, Freemont PS.Sumo.Curr Biol, 2003, 13(7):R258-R259.

[3]Johnson ES.Protein modification by SUMO.Annu Rev Biochem,2004, 73:355-382.

[4]Hayashi T, Seki M, Maeda D, et al.Ubc9 is essential for viability of higher eukaryotic cells.Exp Cell Res, 2002, 280(2):212-221.

[5]Seufert W, Futcher B, Jentsch S.Role of a ubiquitin-conjugating enzyme in degradation of S- and M-phase cyclins.Nature, 1995,373(6509):78-81.

[6]McDoniels-Silvers AL, Nimri CF, Stoner GD, et al.Differential gene expression in human lung adeno-carcinomas and squamous cell carcinomas.Clin Cancer Res, 2002, 8(4):1127-1138.

[7]Mo YY, Yu Y, Theodosiou E, et al.A role for Ubc9 in tumorigenesis.Oncogene, 2005, 24(16):2677-2683.

[8]Moschos SJ, Athanassiou H, Edington H, et al.Proteomic analysis of melanoma-in fi ltrated lymph nodes gains insights into the molecular pro fi le of metastatic melanoma.Proc Amer Assoc Cancer Res,2005(46).

[9]Hayashi T, Seki M, Maeda D, et al.Ubc9 is essential for viability of higher eukaryotic cells.Exp Cell Res, 2002, 280(2):212-221.

[10]Nacerddine K, Lehembre F, Bhaumik M, et al.The SUMO pathway is essential for nuclear integrity and chromosome segregation in mice.Dev Cell, 2005, 9(6):769-779.

[11]Chiu H, Ring BC, Sorrentino RP, et al.dUbc9 negatively regulates the Toll-NF-kappa B pathways in larval hematopoiesis and drosomycin activation in Drosophila.Dev Biol, 2005, 288(1):60-72.

[12]Mao Y, Sun M, Desai SD, et al.SUMO-1 conjugation to topoisomerase I: A possible repair response to topoisomerase-mediated DNA damage.Proc Natl Acad Sci U S A, 2000, 97(8):4046-4051.

[13]Jacquiau HR, vanWaardenburg RC, Reid RJ, et al.Defects in SUMO(small ubiquitin-related modi fi er) conjugation and deconjugation alter cell sensitivity to DNA topoisomerase I-induced DNA damage.J Biol Chem, 2005, 280(25):23566-23575.