富巖，韓國，富俞淞，楊小楠，邢靜，于在林

人粒細(xì)胞刺激因子又稱人粒細(xì)胞集落刺激因子（human granulocyte colony-stimulating factor，hGCSF）是一種多肽細(xì)胞生長因子，可特異地作用于粒系造血祖細(xì)胞，調(diào)節(jié)粒細(xì)胞的增殖與分化，增強(qiáng)粒系終末分化細(xì)胞的功能和增加成熟粒細(xì)胞的產(chǎn)出[1-2]。hGCSF 還是一種調(diào)節(jié)造血干細(xì)胞復(fù)制、增殖、分化以及增強(qiáng)嗜中性粒細(xì)胞趨化、吞噬功能的小分子多肽。重組人粒細(xì)胞刺激因子（rhGCSF）在臨床上成功地用于抗腫瘤放化療后粒細(xì)胞減少癥及感染的治療[3]。在許多體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中都顯示了GCSF 對中性粒細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞的數(shù)量和功能有正向調(diào)節(jié)作用。臨床研究發(fā)現(xiàn)，rhGCSF 除了應(yīng)用在腫瘤患者放化療后的粒細(xì)胞低下癥的治療外，還可明顯改善術(shù)后并發(fā)重癥感染患者的單核細(xì)胞功能缺陷，使其增加 TNF-α 的分泌和上調(diào) HLA-DR 分子的表達(dá)，并通過增加淋巴細(xì)胞數(shù)量、調(diào)節(jié) T 細(xì)胞的增殖分化、增強(qiáng) Th1 的免疫活性（IL-2、干擾素分泌增多）等，逆轉(zhuǎn)了適應(yīng)性免疫細(xì)胞的低應(yīng)答狀態(tài)。rhGCSF 可改善免疫細(xì)胞的活性，為臨床外科防治術(shù)后感染提供了有力的依據(jù)。由于 rhGCSF 的血液半衰期僅有 3.5 h，患者需要每天 1～2 次頻繁給藥[4]。利用 PEG 化學(xué)修飾法對 rhGCSF 進(jìn)行加工，可以使得 rhGCSF 長效化[5]。但是在常規(guī)的原液（成品）基礎(chǔ)上再加工，修飾得率不高，生產(chǎn)成本是常規(guī)藥的 20～60 倍，臨床用藥劑量又較常規(guī) rhGCSF 的最大使用劑量由 300 μg/次提高到 6000 μg/次，是常規(guī) rhGCSF劑量的 20 倍[6]。因此，尋找新的 hGCSF 長效化方法一直在繼續(xù)。

人血清白蛋白（HSA）是一種可溶性的球狀非糖基化蛋白質(zhì)，理論分子量為66471.35 D，含有585 個氨基酸和 17 對二硫鍵。每升人血液中含有50 g 血清白蛋白，是人體血液中蛋白質(zhì)總量的一半以上。作為血液中的最主要和最基本的載體蛋白，其可攜帶和傳遞多肽分子、脂肪酸、類固醇和激素等小分子重要物質(zhì)。白蛋白穩(wěn)定的惰性也是維持血壓的一個重要因素；同時白蛋白在血液中的半衰期約為14～20 d 左右[7]。利用白蛋白可抵御生物體內(nèi)酶解作用的優(yōu)勢，在與治療性蛋白質(zhì)形成融合蛋白后，就使得治療性蛋白質(zhì)的半衰期獲得大大延長。1992年，Yeh 等[8]首次提出了利用酵母分泌的白蛋白/CD4 融合蛋白用于人類疾病的治療設(shè)想。對人血清白蛋白與治療性蛋白質(zhì)所形成的融合蛋白所進(jìn)行研究，展示了一個新的蛋白質(zhì)藥物長效化的技術(shù)方法。本課題組十余年來已開展對多種血細(xì)胞刺激因子、干擾素、白介素及各種皮膚細(xì)胞生長因子與白蛋白形成融合蛋白，作為長效藥物的可能性開展研究，獲得了海量的研究資料，部分結(jié)果已公開[9-14]。其他課題組例如：Halpern 等[15]對人血清白蛋白/粒細(xì)胞刺激因子融合蛋白 Albugranin 開展的動物試驗(yàn)；Osborn 等[16]對人血清白蛋白與干擾素 α2b 融合蛋白（Albuinterferon）在猴體內(nèi)開展的藥代/藥動（PK/PD）試驗(yàn)研究結(jié)果，都顯示不同的人血清白蛋白融合蛋白在動物體內(nèi)均具有比常規(guī)重組蛋白質(zhì)藥物更長的體內(nèi)半衰期特性。融合蛋白 Albuinterferon和 Albugranin 是由釀酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）表達(dá)和制備，而本課題組的融合蛋白是由畢赤酵母菌（Pichia pastoris）表達(dá)制備的。融合蛋白的理化特性研究除了重組人血清白蛋白/干擾素 α2b 融合蛋白有部分較為詳細(xì)的報道外[17-18]，其他融合蛋白的理化特性均未見報道。

本文首次報道了由重組畢赤酵母（Pichia pastoris）工程菌表達(dá)，經(jīng)過分離純化工藝獲得的rHSA/GCSF 理化特性所展開的分析工作。研究獲得的數(shù)據(jù)對理解人血清白蛋白融合蛋白的蛋白質(zhì)特性、融合蛋白形成體內(nèi)長效性提供分子結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)性證明，對同類融合蛋白研究也提供了啟示作用。這些研究結(jié)果也作為《注射用重組人血清白蛋白/粒細(xì)胞刺激因子融合蛋白》的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢定指標(biāo)，用于指導(dǎo)今后臨床用藥的生產(chǎn)質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，具有實(shí)際應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 本研究中使用的化學(xué)試劑均為分析純或藥用級；限制性內(nèi)切酶、DNA 連接酶、聚合酶、胰蛋白酶、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、DNA和蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)品等均購自美國 Promaga 公司；常規(guī)無機(jī)鹽培養(yǎng)基購自美國 Invitrogen 公司；分離純化介質(zhì)填料均來自美國 GE Healthcare 公司；兩性電解質(zhì)購自美國 Ampholyte 公司；等電點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)品購自美國 Bio-Rad 公司；人血清白蛋白特異鼠單克隆抗體購自美國 Sigma 公司，特異識別人粒細(xì)胞刺激因子的鼠單克隆抗體則購自美國 R&D System 公司；重組人粒細(xì)胞刺激因子生物學(xué)活性測定標(biāo)準(zhǔn)品購自中國藥品生物制品檢定所；畢赤酵母菌宿主蛋白檢測試劑盒為美國 Cygnus 公司產(chǎn)品；Dig-DNA 標(biāo)記試劑盒為美國 Roche 公司；改進(jìn)型Lowry蛋白含量檢測試劑盒為美國 Pierce 公司產(chǎn)品；細(xì)菌內(nèi)毒素檢測鱟試劑為中國湛江安度斯生物有限公司產(chǎn)品；糖蛋白染色試劑盒為美國 Thermo公司產(chǎn)品。

1.1.2 儀器 LC-10Avp Plus 高效液相色譜儀為日本島津公司產(chǎn)品；TSK-GEL G2000SWXL（7.8mm×300mm）色譜柱購自日本 TOSOH 公司；十八烷基硅烷鍵合硅膠填充柱購自美國 Agilent 公司（C-18）或天津博納艾杰爾科技公司（Venusil ASB C-18）；氣相色譜儀（Agilent 6890N）和火焰離子化檢測器（FID）為美國 Agilent 公司產(chǎn)品；電泳儀為Bio-Rad 公司產(chǎn)品；全自動控制 200 L 發(fā)酵罐系統(tǒng)為中國江蘇鎮(zhèn)江東方生工公司。

1.2 方法

1.2.1 rHSA/GCSF 的工程表達(dá)菌株的構(gòu)建 采用常規(guī)的基因克隆和 PCR 技術(shù)，人血清白蛋白基因和人粒細(xì)胞刺激因子成熟肽基因片段分別克隆自人胎肝全 RNA 轉(zhuǎn)錄的 cDNA 文庫。PCR 擴(kuò)增的GCSF 成熟肽 DNA 片段插入到帶有分泌肽的人血清白蛋白基因全 DNA 序列的畢赤酵母菌轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pAO815-HSA[21]的 Bsu36I 和該質(zhì)粒 DNA 上的XhoI 限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)之間。人粒細(xì)胞刺激因子成熟肽的 N 端與人血清白蛋白成熟肽的 C 端之間直接基因融合，獲得 pAO815-HSA/GCSF 轉(zhuǎn)移質(zhì)粒。含有全融合蛋白基因序列的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，通過電脈沖轉(zhuǎn)導(dǎo)與畢赤酵母菌 GS115 菌株上 DNA 同源序列間發(fā)生重組，將轉(zhuǎn)移質(zhì)粒中的表達(dá)組盒重組在酵母菌染色體上。具體 DNA 克隆程序和所用的合成HSA 和 hGCSF 的 DNA 引物序列參見文獻(xiàn)[9]。融合蛋白基因表達(dá)啟動子是酵母菌的乙醇氧化酶（AOX1）。當(dāng)使用甲醇作為唯一酵母菌生長碳源，也就同時啟動了融合蛋白的表達(dá)和生產(chǎn)。融合蛋白被直接分泌到酵母菌體外培養(yǎng)液中。

1.2.2 rHSA/GCSF 工程菌種子庫建立和發(fā)酵工藝 高效表達(dá) rHSA/GCSF 融合蛋白的畢赤酵母工程菌按《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2005 版三部《生物制品生產(chǎn)檢定用菌毒種管理規(guī)程》的要求制備主種子庫和工作種子庫。菌種穩(wěn)定性經(jīng)連續(xù)傳代 30 次，驗(yàn)證目的蛋白的表達(dá)水平變化。隨機(jī)選取工程菌菌落 50 個，采用 PCR 方法驗(yàn)證，目的蛋白基因序列是否有陽性反應(yīng)。發(fā)酵生產(chǎn)采用全自動控制 200 L 發(fā)酵罐系統(tǒng)。工作種子經(jīng)二級種子培養(yǎng)擴(kuò)增后（總用時約 36 h），接種于200 L 發(fā)酵罐中，采用常規(guī)無機(jī)鹽培養(yǎng)基或本實(shí)驗(yàn)室改進(jìn)優(yōu)化的無機(jī)鹽培養(yǎng)基進(jìn)行酵母菌菌體的生長和擴(kuò)增（約 24 h），待菌體濕重達(dá)到 350～400 g/L時啟動甲醇流加，進(jìn)入融合蛋白的誘導(dǎo)生產(chǎn)階段（約72 h），甲醇和溶氧濃度均控制在適當(dāng)數(shù)值條件。發(fā)酵工藝基本參照文獻(xiàn)[21]進(jìn)行。

1.2.3 rHSA/GCSF 的分離純化工藝 150 L 含有融合蛋白的發(fā)酵液經(jīng)板框過濾或連續(xù)流離心機(jī)將上清液和菌體分離。上清液經(jīng) 0.22 μm 濾芯除去不溶物和顆粒狀物質(zhì)后，利用蠕動泵將含融合蛋白的上清液，直接上經(jīng)平衡液（25mmol/L NaAc，pH 5.0）平衡的含 Capto-MMC 介質(zhì)的層析柱，上樣后用平衡液再平衡；使用緩沖液（50mmol/L PB，pH 7.0）將雜蛋白洗脫，緩沖液（50mmol/L PB，pH 7.0，0.6 mol/L NH4Cl）將融合蛋白洗脫，純度達(dá) 80%以上；融合蛋白可進(jìn)一步經(jīng) Butyl-SepharoseTM4 FF作為配基的疏水性介質(zhì)（HIC）純化，使之純度達(dá)95%以上。融合蛋白再進(jìn)一步經(jīng)離子交換層析填料做進(jìn)一步精純，最后經(jīng) G25 介質(zhì)填料脫鹽，獲得純度達(dá) 98%以上的融合蛋白，作為注射用重組人血清白蛋白/粒細(xì)胞刺激因子融合蛋白原料藥（原液）。rHSA/GCSF 的分離純化工藝基本參照文獻(xiàn)[19]。原液的蛋白含量測定采用《中國藥典》2005版三部[22]，附錄 VIB 蛋白質(zhì)測定法第二法 Lowry 法進(jìn)行測定。原液中的細(xì)菌內(nèi)毒素測定采用文獻(xiàn)[22]附錄XIIE 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法中的凝膠法，檢測細(xì)菌內(nèi)毒素試劑盒的鱟試劑標(biāo)定靈敏度為0.25 EU/ml。

1.2.4 rHSA/GCSF 免疫學(xué)鑒別 純化制備的rHSA/GCSF 按文獻(xiàn)[22]附錄 VIIIA 免疫印跡法和VIIIB 免疫斑點(diǎn)法進(jìn)行兩種抗體的分別鑒別，人血清白蛋白特異鼠單克隆抗體和特異識別人粒細(xì)胞刺激因子的鼠單克隆抗體第一抗體稀釋比為300～1000 倍；第二抗體（熒光標(biāo)記抗體）的使用則按生產(chǎn)單位操作說明書執(zhí)行。

1.2.5 rHSA/GCSF 的體外細(xì)胞學(xué)生物活性測定 rHSA/GCSF 的體外細(xì)胞學(xué)生物活性測定采用NFS-60 細(xì)胞/MTT 比色法，按 Shirafuji 等[23]提供的方法進(jìn)行測定。

1.2.6 rHSA/GCSF 物理特性

1.2.6.1 rHSA/GCSF 純度分析

1.2.6.1.1 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法（SDSPAGE） rHSA/GCSF 原液的電泳純度測定采用還原型或非還原型 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法進(jìn)行測定。分離膠濃度為7.5%，每個泳道上樣量應(yīng)不低于 10 μg（考馬斯亮藍(lán) R250 染色），對電泳結(jié)果用掃描儀成像，應(yīng)用分析軟件分析各條帶的百分比，計算目的蛋白所占百分比。

1.2.6.1.2 高效液相法（RP-HPLC 和 SECHPLC） 采用十八烷基硅烷鍵合硅膠填充柱，以 A相（三氟乙酸-水溶液：取 1.0 ml 三氟乙酸加水至1000 ml，充分混勻）、B 相（三氟乙酸-乙腈溶液：取 1.0 ml 三氟乙酸加乙腈至 1000 ml，充分混勻）為流動相，在室溫條件下，進(jìn)行梯度洗脫（20%～70%B 相，適宜時長）。上樣量不低于 10 μg，檢測波長為214 和 280 nm 雙波長。以 rHSA/GCSF 色譜峰計算理論塔板數(shù)應(yīng)不低于 1500。按面積按歸一化法計算，rHSA/GCSF 峰面積要求不低于總面積的95.0%。rHSA/GCSF 原液經(jīng)緩沖液置換后，采用常規(guī)的凝膠分子排阻-高效液相法（SEC- HPLC）進(jìn)行純度測定，方法與 RP-HPLC 方法相同。

1.2.6.2 rHSA/GCSF 分子量測定

1.2.6.2.1 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法 采用還原型 SDS-PAGE 測定 rHSA/GCSF 分子量，分離膠濃度為10%，上樣量為1 μg。經(jīng)考馬斯亮藍(lán) R250染色，用掃描儀對電泳結(jié)果成像，應(yīng)用分析軟件計算已知分子量標(biāo)準(zhǔn)品各條帶的相對遷移率距離制作直線回歸，根據(jù)目的蛋白遷移率距離帶入直線回歸方程計算出 rHSA/GCSF 分子量。

1.2.6.2.2 激光質(zhì)譜法 rHSA/GCSF 的質(zhì)譜分子量是由北京國家生化藥物測試中心承擔(dān)。檢測條件：N2激光源，波長 337 nm；檢測方式：正離子，線性方式（飛行管長 1.5 m，加速電壓 20 kV），基質(zhì)：SA。與 rHSA/GCSF 氨基酸序列的理論分子量進(jìn)行比較。

1.2.6.3 圓二色光譜分析 遠(yuǎn)紫外區(qū)圓二色 CD光譜主要反映肽鍵的圓二色性，辨識蛋白質(zhì)的二級和三級結(jié)構(gòu)。rHSA/GCSF的圓二色光譜測定工作由中國科學(xué)院過程工程研究所生化工程國家重點(diǎn)研究室承擔(dān)。

1.2.6.4 甲醇和甘油殘留量測定 rHSA/GCSF 的發(fā)酵生產(chǎn)制備過程中使用的培養(yǎng)基中含有甘油作為碳源。理論上，甘油在酵母菌生長和擴(kuò)增過程中完全消耗后才轉(zhuǎn)為使用甲醇作為碳源和重組融合蛋白的表達(dá)誘導(dǎo)劑。為了用藥完全，有必要對 rHSA/GCSF 原液樣品中的甘油和甲醇?xì)埩袅窟M(jìn)行檢測。氣相色譜儀和火焰離子化檢測器（FID）用于甘油和甲醇檢測，方法為毛細(xì)管柱頂空進(jìn)樣等溫法[24-25]，以不同量甲醇或甘油作為標(biāo)準(zhǔn)品參照，每個量點(diǎn)連續(xù)進(jìn)樣 2 次，測量參照標(biāo)準(zhǔn)品溶液的峰面積，記錄色譜圖。待測樣品則按相同方法進(jìn)樣和測定，根據(jù)用標(biāo)準(zhǔn)品制備的曲線，計算出待測樣品中的甘油或甲醇含量（殘留量）。甲醇的殘留量測定也采用了變色酸比色法[26]進(jìn)行比較。

1.2.6.5 宿主蛋白和外源性 DNA 殘留量測定 使用畢赤酵母菌進(jìn)行 rHSA/GCSF 的生產(chǎn)和制備，在純化的原料藥中含有多少宿主蛋白質(zhì)和外源性 DNA（雜質(zhì)）是需要確定的，以保證在臨床用藥時，這些殘存的宿主物質(zhì)不會帶來臨床上的異源蛋白刺激反應(yīng)。畢赤酵母菌的宿主蛋白質(zhì)殘留量測定，操作方法參照廠家提供的說明書進(jìn)行。畢赤酵母菌的宿主 DNA 殘留量測定，采用自制提取畢赤酵母菌總DNA，利用 Dig-DNA標(biāo)記試劑盒制備畢赤酵母菌的總 DNA 探針。rHSA/GCSF 原液中殘留的外源性DNA 經(jīng)變性為單鏈 DNA 吸附于固相膜上，在一定溫度下與相匹配的單鏈 DNA 探針標(biāo)記復(fù)性而雜交結(jié)合為雙鏈 DNA，并使用相應(yīng)的顯示系統(tǒng)顯示雜交結(jié)果，與已知含量的陽性 DNA 對照比對后，給出待測原液中的宿主 DNA 殘留量數(shù)值。

1.2.7 rHSA/GCSF 化學(xué)特性

1.2.7.1 N 端氨基酸序列分析 rHSA/GCSF 的N 端前 15 個氨基酸序列測定由北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院按 Edman 降解法進(jìn)行測定。適量 rHSA/GCSF原液樣品對純水充分透析，轉(zhuǎn)移至經(jīng)預(yù)處理的 PVDF膜上，干燥后直接在蛋白質(zhì) N 端氨基酸測序儀按標(biāo)準(zhǔn)測定方法，測定 rHSA/GCSF 的前 15 個氨基酸的序列。

1.2.7.2 等電點(diǎn)分析 rHSA/GCSF 的等電點(diǎn)測定采用常規(guī)的等電聚焦垂直板電泳法測定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的等電點(diǎn)（pI）對其相應(yīng)的遷移率距離作直線回歸，將 rHSA/GCSF 的遷移距離代入直線回歸方程，求出待測樣品的等電點(diǎn)。

1.2.7.3 糖基化分析 rHSA/GCSF 原液和糖蛋白陽性對照品辣根過氧化物酶糖蛋白和重組人促紅細(xì)胞生成素（rhEPO）、糖蛋白陰性對照品大豆胰蛋白酶抑制因子一起進(jìn)行 SDS-PAGE 分離，進(jìn)行糖蛋白染色的電泳膠在掃描儀上掃描，再用考馬斯亮藍(lán)R250 復(fù)染，掃描成像。

1.2.7.4 紫外光譜測定 rHSA/GCSF 的紫外光譜測定以 10mmol/L 磷酸鹽緩沖液（pH 5.5）為空白對照液，在常規(guī)紫外可見分光光度計上對rHSA/GCSF 原液稀釋樣品（用空白對照液稀釋至0.1 mg/ml）進(jìn)行 450～260 nm 波長的連續(xù)掃描，測定其最大吸收峰波長。

1.2.7.5 自由巰基測定 自由巰基測定采用質(zhì)譜分子量測定方法，由北京蛋白質(zhì)組研究中心進(jìn)行測定。將經(jīng)烷基化處理封閉自由巰基和未經(jīng)處理的同一來源 rHSA/GCSF 原液按 1.2.6.2.2 中描述的質(zhì)譜分子量測定方法進(jìn)行比較，每一個烷基的分子量為57 D。

1.2.7.6 肽圖譜（RP-HPLC 法和肽質(zhì)量指紋質(zhì)譜法）

1.2.7.6.1 胰蛋白酶裂解-反相高效液相色譜法 取rHSA/GCSF 原液稀釋至濃度為1 mg/ml，用 1%碳酸氫銨溶液充分透析，以終濃度 0.01 mol/L 二硫蘇糖醇（DTT）在 56℃下還原 60min，以終濃度0.055 mol/L 碘乙酰胺室溫避光烷基化 30min，按1∶50（mg/mg）加入胰蛋白酶溶液[取甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮處理過的（或序列分析純）胰蛋白酶適量，加 1%碳酸氫銨溶液溶解，制成濃度為0.1 mg/ml的溶液]到供試品溶液中，在 37℃保溫 24 h 后，按 1∶10 加入 50%醋酸溶液，以 10 000 r/min 離心 5min（或通過 0.45 μm 膜過濾），精密量取上清液 100 μl，注入高效液相色譜儀，通過辛烷基硅烷鍵合硅膠或十八烷基硅烷鍵合硅膠柱進(jìn)行梯度洗脫，流動相及洗脫程序?yàn)锳 液為0.1%三氟乙酸-水溶液，B 液為0.1%三氟乙酸-乙腈溶液。以流速為1 ml/min，梯度洗脫 70min（A 液從 100%～30%，B 液從 0～70%），檢測波長為214 nm 記錄色譜圖。

1.2.7.6.2 激光質(zhì)譜肽質(zhì)量指紋圖譜的測定 使用基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測，由北京蛋白質(zhì)組研究中心承擔(dān)。取待測樣品 10 μl，加入 10 μl 100mmol/L NH4HCO3溶液，加入 100mmol/L DTT 至終濃度 10mmol/L，56℃反應(yīng) 1 h。冷卻至室溫后，加入 250mmol/L IAA 至終濃度 25mmol/L，避光反應(yīng) 1 h。加入 0.5 μg Trypsin，37℃反應(yīng) 12 h。將上述酶切產(chǎn)物與基質(zhì)按 1∶3 混合點(diǎn)于靶上，自然晾干后，反射正離子模式（掃描范圍 m/z 500～5 000）和線性正離子模式（掃描范圍 m/z 3 000～20 000）下測定肽質(zhì)量指紋譜（PMF），以已知 rHSA/GCSF 氨基酸序列肽段分子量進(jìn)行比對。

2 結(jié)果

2.1 rHSA/GCSF 工程菌的構(gòu)建和表達(dá)產(chǎn)物

利用基因工程技術(shù)構(gòu)建的畢赤酵母工程菌種表達(dá)重組人血清白蛋白/粒細(xì)胞刺激因子融合蛋白（rHSA/GCSF）成熟肽的理論氨基酸序列見圖1。分泌到發(fā)酵液中的融合蛋白是可溶性的蛋白質(zhì)，具有 759 個氨基酸，rHSA/GCSF 的理論計算分子量為85215 D，等電點(diǎn)（pI）5.799；共有 19 個二硫鍵，分別為53-62，75-91，90-101，124-169，168-177，200-246，245-253，265-279，278-289，316-361，360-369，392-438，437-448，461-477，476-487，514-559，558-567，621-627（34hGCSF42），649-659（64hGCSF74）。HSA 的第34 個半胱氨酸（C）有一個游離的自由巰基。第602 位（在 hGCSF 氨基酸序列的第17 位）的半胱氨酸（C）也有一個游離自由巰基。

圖1 重組人血清白蛋白/粒細(xì)胞刺激因子融合蛋白（rHSA/GCSF）成熟肽氨基酸序列Figure 1 The amino acid sequences of mature peptide of recombinant human serum albumin/granulocyte colonystimulating factor fusion protein (rHSA/GCSF)

2.2 rHSA/GCSF 的大規(guī)模發(fā)酵工藝的建立

對表達(dá) rHSA/GCSF 的工程菌進(jìn)行主種子庫和工作種子庫的建立和檢定使之符合國家對生物制品生產(chǎn)用菌種的要求。隨機(jī)選取 50 個工程菌菌落，進(jìn)行目的基因 PCR 檢測，為100%陽性。酵母重組工程菌經(jīng)連續(xù) 30 個代次的傳代，目的蛋白表達(dá)水平穩(wěn)定，與原始菌種相同。采用 5 L、30 L 和 200 L不同規(guī)模的發(fā)酵系統(tǒng)進(jìn)行工程菌的發(fā)酵測試和優(yōu)化，確定了 rHSA/GCSF 畢赤酵母工程菌在 200 L規(guī)模的發(fā)酵工藝。工程菌經(jīng)二級種子階段培養(yǎng)擴(kuò)增后，在 200 L 生產(chǎn)罐中再擴(kuò)增至菌體濕重達(dá) 350～400 g/L 時，啟動甲醇添加，連續(xù)灌注甲醇 72 h，結(jié)束融合蛋白的誘導(dǎo)和生產(chǎn)。融合蛋白分泌到酵母細(xì)胞外的培養(yǎng)液中，取不同時間誘導(dǎo)時的發(fā)酵上清液 20 μl 進(jìn)行還原和非還原（圖2，泳道 4）的SDS-PAGE 分析結(jié)果顯示，72 h 時發(fā)酵上清液中總蛋白（不低于 1 g）的 40%是 rHSA/GCSF 單體融合蛋白目的產(chǎn)物（圖2）。從不同時間的誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果可以看出，隨著時間的延長，酵母菌分泌的目的蛋白獲得積累，增加上清液中的融合蛋白含量。同時，觀察表明目的蛋白表達(dá)產(chǎn)物（rHSA/ GCSF）也還是有被降解和形成聚合體的現(xiàn)象存在。融合蛋白的降解物存在，會對目的蛋白的分離純化有直接影響。因?yàn)槟康牡鞍捉到馕锸呛湍康牡鞍拙哂邢嗤碾亩?，親和層析介質(zhì)和疏水介質(zhì)（HIC）在特異結(jié)合目的蛋白時會受到競爭性結(jié)合影響。為此，雖然延長生長時間，單位產(chǎn)量會有巨大的增加，但是可能會為下游的純化帶來困難，因此限定誘導(dǎo) 72 h 左右時結(jié)束誘導(dǎo)，進(jìn)入融合蛋白的分離純化程序?？梢源_定畢赤酵母工程菌株的 rHSA/GCSF 表達(dá)水平不低于 300 mg/L（72 h），發(fā)酵工藝可線性放大、無機(jī)鹽培養(yǎng)基組分簡單、成本低廉可滿足今后產(chǎn)業(yè)化的要求。

圖2 在 200 L 發(fā)酵罐中畢赤酵母工程菌經(jīng)甲醇誘導(dǎo)表達(dá)重組人血清白蛋白/粒細(xì)胞刺激因子融合蛋白（rHSA/GCSF）Figure 2 The rHSA/GCSF expression by methanol induced from a genetically engineered Pichia pastoris strain in a 200 L bio-reactor (fermenter)

2.3 rHSA/GCSF 蛋白質(zhì)分離純化

圖3 顯示出融合蛋白從發(fā)酵上清液，經(jīng)上述3 個分離純化步驟，逐步純化的過程，也展示出為達(dá)到分離純化的目的，每個介質(zhì)填料的分離功能。精純獲得的 rHSA/GCSF 溶液，按改進(jìn)型 Lowry法測定，蛋白質(zhì)含量在 5 mg/ml 左右，細(xì)菌內(nèi)毒素含量在 1 EU/ml 以下。制備的 rHSA/GCSF 溶液符合生物制品要求的純度，可以作為《注射用重組人血清白蛋白/粒細(xì)胞刺激因子融合蛋白》的原料藥（原液）。

圖3 從發(fā)酵上清液中經(jīng)三種介質(zhì)層析分離純化的 rHSA/GCSF 融合蛋白Figure 3 rHSA/GCSF was purified from the fermentation supernatant through a three-step chromatography

2.4 rHSA/GCSF 免疫鑒別

rHSA/GCSF 是由兩個蛋白質(zhì)分子融合組成的，通過免疫印跡試驗(yàn)檢測結(jié)果顯示，特異識別人血清白蛋白的單克隆抗體與 rHSA/GCSF 有特異的免疫學(xué)反應(yīng)，也與作為陽性對照品的血源人血清白蛋白（pHSA）和酵母菌表達(dá)的重組 HSA（rHSA）有免疫反應(yīng)，但不與陰性對照品人粒細(xì)胞刺激因子（rhGCSF）有免疫反應(yīng)；特異識別人粒細(xì)胞刺激因子的單克隆抗體則與 rHSA/GCSF 和陽性對照品重組人粒細(xì)胞刺激因子（rhGCSF）有免疫特異反應(yīng)，但不與陰性對照品 pHSA 和 rHSA 有特異反應(yīng)（圖4）。免疫斑點(diǎn)法可以獲得相同的鑒別結(jié)果。

圖4 rHSA/GCSF 的免疫印跡鑒別試驗(yàn)（A：人粒細(xì)胞刺激因子單克隆抗體；B：人血清白蛋白單克隆抗體）Figure 4 The western-blotting results are from different first antibodies, mouse-monoclonal antibody against human granulocyte-colony stimulating factor (A) or mousemonoclonal antibody against human serum albumin (B)

2.5 rHSA/GCSF 的體外細(xì)胞學(xué)生物活性測定

rHSA/GCSF 原液的體外細(xì)胞學(xué)生物活性測定結(jié)果表明，融合蛋白 rHSA/GCSF 的生物比活性不低于 1.5×107IU/mg，而 rhGCSF 的生物比活性不低于 6.0×107IU/mg[22]。rHSA/GSCF 和 rhGCSF的分子質(zhì)量比為85.2 kD∶18.67 kD = 4.6∶1。由此計算，在等摩爾時（4.6 mg 融合蛋白中有 1 mg 是GCSF），兩者的生物活性沒有差異（即 4.6 mg 的rHSA/GCSF 具有 6.9×107IU 的生物活性）。

2.6 rHSA/GCSF 蛋白質(zhì)的物理特性分析

2.6.1 rHSA/GCSF蛋白質(zhì)純度分析 取 10 μg的 rHSA/GCSF 蛋白質(zhì)在非還原條件下做 SDSPAGE，掃描后經(jīng)分析軟件計算，結(jié)果顯示分離純化的 rHSA/GCSF 電泳純度達(dá) 99%（圖3，泳道5）；反相-高效液相（RP-HPLC）在波長 280 nm 和214 nm 記錄結(jié)果顯示均為單一峰，峰面積不低于總面積的 98%（圖5）。rHSA/GCSF 經(jīng)凝膠分子排阻-高效液相（SEC-HPLC）測定獲得相同的結(jié)果。因此，在原液中可能存在的單體 GCSF 分子、單體 HSA 分子和聚合體形式的 rHSA/GCSF，總共不會高于 20 μg/mg。

圖5 融合蛋白 rHSA/GCSF 原液的反相-高效液相色譜法分析圖譜（檢測波長分別為214 nm 和 280 nm，藍(lán)色為280 nm測定的峰圖，純度為99.384%；咖啡色為214 nm 測定的峰圖，純度為99.364%）Figure 5 The purity of rHSA/GCSF was analyzed by RP-HPLC at UV wave length 214 or 280 nm.(The blue color shows the purity is about 99.384%at 280 nm; the coffee color shows the protein purity is around 99.364%at 214 nm)

2.6.2 分子量測定 rHSA/GCSF 的分子量測定采用 SDS-PAGE 方法，在還原條件下以已知蛋白質(zhì)分子量為參照物進(jìn)行的直線回歸方程計算，分子量測定結(jié)果為（85±8.6）kD。對 rHSA/GCSF 理化對照品用基質(zhì)輔助激光解吸飛行時間質(zhì)譜儀進(jìn)行測定為1 個峰，分子量為85 305 D，與理論分子量 85 215 D 值相近。

2.6.3 紫外圓二色光譜分析 應(yīng)用紫外圓二色光譜儀分別對 rHSA/GCSF、rGCSF 和 rHSA 蛋白質(zhì)溶液開展了遠(yuǎn)紫外光譜分析測定，對所獲得的光譜曲線分別進(jìn)行了疊加分析比較。在圖6 中顯示了rHSA + rGCSF、rHSA/GCSF、rHSA 和 rhGCSF 分子間圓二色光譜疊加。結(jié)果顯示重組人血清白蛋白/粒細(xì)胞刺激因子融合蛋白和重組人血清白蛋白、重組人粒細(xì)胞刺激因子理論加和后疊加的圓二色圖形相似度非常高，表明在融合蛋白中的人血清白蛋白和人粒細(xì)胞刺激因子的各自空間結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)的二級和三級結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生改變。本課題組也開展了重組 HSA（rHSA）和血源 HSA（pHSA）的紫外圓二色圖譜疊加分析沒有明顯可見差異，因此可以肯定，用 pHSA 和 rGCSF 與 rHSA/GCSF 的圓二色圖譜分析獲得的結(jié)果與使用 rHSA 獲得的結(jié)果應(yīng)是一致的。

圖6 對 rHSA/GCSF 蛋白質(zhì)紫外圓二色疊加圖譜分析Figure 6 Protein UV-Circular dichroism spectra (CD)analysis of rHSA/GCSF

2.6.4 甲醇和甘油殘留量測定 無論采用變色酸比色法還是氣相色譜法，在 rHSA/GCSF 原液中甲醇?xì)埩袅慷荚?0.0001%（g/g）以下，遠(yuǎn)低于《中國藥典》2005 版二部對原料藥中殘留溶劑-甲醇的限度要求值（0.3%）。采用氣相色譜法測定甘油在原液中的殘留量，結(jié)果顯示殘留量低于儀器和方法檢出下限值，可以判定為未檢出。

2.6.5 宿主蛋白質(zhì)和外源性 DNA 殘留量 采用商品試劑盒檢測了 rHSA/GCSF 原液中的畢赤酵母菌宿主蛋白的殘留量，結(jié)果表明原液中的宿主菌蛋白質(zhì)含量在 0.05%以下，測定的回收率值在70%～130%之間，符合國家對注射用重組蛋白質(zhì)藥物中宿主蛋白質(zhì)殘留量限定的要求。rHSA/GCSF原液中的畢赤酵母菌外源性 DNA 殘留量經(jīng)測定，每毫克融合蛋白或以臨床上劑量計算均小于10 ng/人。

2.7 rHSA/GCSF 的化學(xué)特性

2.7.1 N 端氨基酸序列測定 rHSA/GCSF 的 N端氨基酸序列測定的結(jié)果為：Asp-Ala-His-Lys-Ser-Glu-Val-Ala-His-Arg-Phe-Lys-Asp-Leu-Gly-，（D-AH-K-S-E-V-A-H-R-F-K-D-L-G-），與 rHSA/GCSF 氨基酸理論序列前 15 個氨基酸的序列相符。對不同批次制備的 rHSA/GCSF 原液，經(jīng)不同檢測單位（中國藥品生物制品檢定所和北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院）進(jìn)行的 N 端氨基酸序列測定都獲得相同的結(jié)果。

2.7.2 等電點(diǎn)測定 rHSA/GCSF 的等電點(diǎn)測定結(jié)果為pI = 5.8 與理論值（pI 5.79）相近。

2.7.3 糖基化分析 利用高碘酸希夫堿（PAS）試劑法對糖蛋白進(jìn)行檢測。對 5 μg 的 rHSA/GCSF經(jīng)過 SDS-PAGE 分離后使用試劑盒進(jìn)行染色，隨后經(jīng)考馬斯亮藍(lán) R250 復(fù)染的電泳膠（圖7）進(jìn)行比較，顯示 rHSA/GCSF為非糖基化或低糖基化蛋白。

圖7 rHSA/GCSF 蛋白質(zhì)的糖基化染色測定和考馬斯亮藍(lán)復(fù)染色 SDS-PAGE 電泳分析Figure 7 Glycoprotein staining and coomassie brilliant blue re-staining of rHSA/GCSF SDS-PAGE

2.7.4 紫外光譜測定 rHSA/GCSF 原液呈典型蛋白質(zhì)紫外吸收峰，最大吸收峰波長位于 277 nm左右。

2.7.5 自由巰基測定 rHSA/GCSF 樣品烷基化封閉和不封閉條件下測試的質(zhì)譜分子量分別為85512.2 D 和 85652.1 D，兩者之差為139.9 D，計算 139.9/57 = 2.4，表明rhSA/GCSF 中含有 2.4 個自由巰基。理論氨基酸序列中，rHSA/GCSF 含有2 個自由巰基（半胱氨酸 C）分別位于第34 位和第602 位，因此測定值與理論值基本一致。

2.7.6 肽圖分析 rHSA/GCSF 經(jīng)變性和烷基化后，胰蛋白酶水解獲得 RP-HPLC 肽圖（圖8）。肽圖的結(jié)果批次間重現(xiàn)率很好，可以作為rHSA/CSF 原液的質(zhì)量鑒別指標(biāo)之一。根據(jù)已知 rHSA/CSF 的全長氨基酸序列計算出理論肽譜，將實(shí)測肽質(zhì)量指紋圖譜與理論圖譜進(jìn)行比對，檢出氨基酸序列的覆蓋率為84%（圖1 中陰影部分）。rHSA/CSF 的 N 端氨基酸序列完全匹配到 257 個氨基酸殘基；C 端匹配到 27 個殘基。HSA 的 C 端和GCSF 蛋白質(zhì)分子的 N 端，直接相連的氨基酸序列部位也清楚檢出。rHSA/GCSF 的肽序列中氨基酸第627 至第731 之間的肽序列未能得到匹配，可能是因?yàn)檫@個肽段的氨基酸序列中既沒有精氨酸 Arg（R）也沒有賴氨酸 Lys（K），而精氨酸和賴氨酸是胰蛋白酶的酶切識別位點(diǎn)，由此形成一個長達(dá) 104 個氨基酸組成的長肽鏈。當(dāng)待測蛋白質(zhì)樣品形成一個較長的多肽鏈時，會受到其他肽鏈的電荷干擾，就不能獲得較好的匹配。

3 討論

我們構(gòu)建的表達(dá) rHSA/GCSF 的重組畢赤酵母工程菌菌種傳代穩(wěn)定。所建立的發(fā)酵工藝經(jīng)近百罐次不同規(guī)模的發(fā)酵驗(yàn)證，顯示生產(chǎn)工藝穩(wěn)定、具可重復(fù)性和線性放大能力，無機(jī)鹽發(fā)酵培養(yǎng)基的配方組分簡單，適合于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)重組人血清白蛋白/粒細(xì)胞刺激因子融合蛋白的要求。畢赤酵母工程菌表達(dá)的融合蛋白與抗人血清白蛋白或人粒細(xì)胞刺激因子的單克隆抗體分別有免疫學(xué)特異反應(yīng)。通過體外細(xì)胞生物學(xué)活性測定，融合蛋白展示出人粒細(xì)胞刺激因子特有的生物學(xué)活性功能，并沒有因與大分子 HSA 蛋白質(zhì)形成融合蛋白后，產(chǎn)生體外生物活性顯著下降的現(xiàn)象。這個結(jié)果與我們對人血清白蛋白與其他治療性蛋白質(zhì)藥物所開展的研究結(jié)果有著極為顯著的不同。例如人血清白蛋白與干擾素 α 形成的融合蛋白，其體外抗病毒的生物學(xué)活性丟失 2 個數(shù)量級以上，有著極為顯著的體外生物學(xué)活性的下降[18]。rHSA/GCSF 的生物活性沒有喪失是由于處于融合蛋白中的 GCSF 分子與測活用細(xì)胞表面 GCSF 的特異受體相結(jié)合的氨基酸空間結(jié)構(gòu)區(qū)域，處于融合蛋白的表面，沒有受到 HSA 大分子空間構(gòu)型的干擾和影響所決定的。rHSA/GCSF 的蛋白質(zhì)純化工藝經(jīng)多批次驗(yàn)證，工藝穩(wěn)定可靠，并可線性放大。經(jīng)發(fā)酵和純化工藝獲得的 rHSA/GCSF 原液符合臨床用藥對原料藥純度的要求，可以作為《注射用重組人血清白蛋白/粒細(xì)胞刺激因子融合蛋白》的原料藥（原液）。

圖8 在還原/烷基化條件下獲得的不同批次制備的 rHSA/GCSF 融合蛋白的 RP-HPLC 肽圖（A：批號為9314Y20080802；B：批號為9314Y20090305）Figure 8 The enzymatic peptide maps from different lots of rHSA/GCSF preparation under RP-HPLC chromatography (A：9314Y20080802；B：9314Y20090305)

對 rHSA/GCSF 開展的自由巰基分析結(jié)果肯定了在 rHSA/GCSF 蛋白質(zhì)上有兩個自由巰基，這與理論值相符。研究結(jié)果表明，在正確構(gòu)象下的HSA 或 rHSA/GCSF 的第34 位半胱氨酸含有的自由巰基（C）不會與正確構(gòu)象的另一個 HSA 分子或另一個 rHSA/GCSF 分子之間的這個自由巰基形成共價二硫鍵，這是因?yàn)榈?4 位的半胱氨酸被包裹在 HSA 分子內(nèi)部，兩個 HSA 分子之間不會形成以共價二硫鍵形式結(jié)合的二聚體，僅可形成電荷相吸形式的聚合體。rHSA/GCSF 的第602 位的半胱氨酸含有的自由巰基則可與另一個 GCSF（C17）或另一個 rHSA/GCSF（C602）蛋白質(zhì)分子上的自由巰基形成共價二硫鍵（形成共價形式的二聚體后不能被輕易打開成為兩個單體形式的蛋白質(zhì)分子），形成聚合體形式后 GCSF 的生物活性將大大下降。當(dāng)兩個 rHSA/GCSF 之間通過這個 C形成共價二硫鍵形式的聚合體，或者一個 rHSA/GCSF 和一個 GCSF 之間形成聚合體時，這個聚合體是不可再轉(zhuǎn)化成單體蛋白質(zhì)分子的（當(dāng)兩個GCSF 之間由自由巰基形成共價二硫鍵聚合體時，可以通過變性-再復(fù)性，來獲得兩個單體活性 GCSF分子，而融合蛋白是不能通過復(fù)性-再復(fù)性的方法成為單體融合蛋白的）。在 rHSA/GCSF 的生產(chǎn)和制備過程中需要特別注意減少聚合體形成的機(jī)會。提高單體 rHSA/GCSF 的得率和在注射劑的成品中維持單體狀態(tài)的 rHSA/GCSF 是生產(chǎn)和質(zhì)量評價的決定性關(guān)鍵技術(shù)指標(biāo)。

rHSA/GCSF 的理化特性分析表明，經(jīng)分離純化的融合蛋白在物理特性分析中顯示，在 SDSPAGE 電泳、RP-HPLC 和 SEC-HPLC 測定中均呈單一峰；對原液中的甲醇、甘油、畢赤酵母菌宿主蛋白質(zhì)和外源性 DNA 的殘留量進(jìn)行測定方法的建立，方法學(xué)驗(yàn)證，檢定結(jié)果表明 rHSA/GCSF 原液的蛋白質(zhì)純度分析結(jié)果可靠、各種外源物質(zhì)的殘留量均符合治療用生物制品對外源物質(zhì)殘留量的要求。對 rHSA/GCSF 的化學(xué)特性分析結(jié)果表明融合蛋白的紫外吸收特性測定，顯示具有蛋白質(zhì)特定的紫外吸收峰值；融合蛋白的等電點(diǎn)和分子量鑒定結(jié)果也符合理論計算值；N 端蛋白質(zhì)序列測定證明了由畢赤酵母菌分泌出的 rHSA/GCSF 融合蛋白的切割加工過程正確，獲得的融合蛋白是單一肽鏈序列，結(jié)合所進(jìn)行的肽質(zhì)量指紋圖譜測定，融合蛋白的 N 端、C 端可以完整匹配，也證明由畢赤酵母菌表達(dá)，獨(dú)創(chuàng)的分離純化工藝制備的融合蛋白的蛋白質(zhì)分子是完整的。圓二色光譜分析證明rHSA/GCSF融合蛋白的 HSA 和 GCSF 分子各自的空間結(jié)構(gòu)沒有因?yàn)樾纬扇诤系鞍锥l(fā)生分子錯配現(xiàn)象，維持了各自的二硫鍵正確配對；所建立的融合蛋白純度測定方法簡單可行。利用 RP-HPLC進(jìn)行融合蛋白的肽圖分析方法簡單，重現(xiàn)性高而且圖形穩(wěn)定，可以作為與理化對照品或批次間原液生產(chǎn)制備的鑒別手段之一。

對比文獻(xiàn)[15-16]使用釀酒酵母表達(dá)的 rHSA/IFNα2b 和 rHSA/GCSF 融合蛋白，我們使用畢赤酵母來表達(dá) rHSA/GCSF要有較明顯的優(yōu)勢，首先是表達(dá)量要高 10～100 倍，其次融合蛋白被酵母糖基化水平也要低得多?？梢源_定通過畢赤酵母工程菌表達(dá)，經(jīng)分離純化獲得的 rHSA/GCSF 純品，符合作為原料藥的要求，rHSA/GCSF 的分子結(jié)構(gòu)清楚，制備工藝穩(wěn)定、可重復(fù)和具有線性放大的能力，藥物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)明確、全面，檢定方法穩(wěn)定可靠。通過對 rHSA/GCSF 蛋白質(zhì)理化特性所開展的獨(dú)立研究，我們獲得了十分有益的數(shù)據(jù)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以指導(dǎo)原料藥的生產(chǎn)和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)指標(biāo)的建立。本課題組將繼續(xù)報道利用所制備的原料藥進(jìn)行注射用重組人血清白蛋白/粒細(xì)胞刺激因子融合蛋白新藥研發(fā)的制劑配方篩選研究和已完成的藥效學(xué)、藥動/藥代、毒代、急毒、長毒相關(guān)的藥理毒理安全性評價的研究結(jié)果。

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