趙葉琳，趙曉寅，孫凌云，侯亞義

人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）具有免疫抑制作用和多向分化潛能，被用于治療各種疾病。而雌激素與許多自身免疫性疾病的發(fā)生與發(fā)展有關(guān)，以前的研究中發(fā)現(xiàn) 17β-雌二醇（E2）能影響破骨細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞骨架的結(jié)構(gòu)，下調(diào)微絲肌動蛋白（F-actin）的表達(dá)，降低破骨細(xì)胞的活動能力，從而抑制破骨細(xì)胞的骨吸收功能[1-2]。E2對 MSC 有多種調(diào)節(jié)作用，如能抑制 MSC 的成骨分化[3]及抑制 MSC 的免疫調(diào)節(jié)功能[4]。但關(guān)于 E2 對 MSC 細(xì)胞骨架和超微結(jié)構(gòu)的影響還未見報道。

F-actin 呈纖維狀，是構(gòu)成細(xì)胞內(nèi)微絲骨架的主要部分。肌動蛋白相關(guān)蛋白2/3（Arp2/3）復(fù)合物又是構(gòu)成 F-actin 的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[2]。F-actin 在細(xì)胞內(nèi)的聚合及解聚，與細(xì)胞的運(yùn)動、形態(tài)及細(xì)胞內(nèi)外的信息傳遞等功能有關(guān)，為細(xì)胞內(nèi)外信息傳遞提供分子橋梁，控制細(xì)胞形態(tài)、運(yùn)動和增殖等生物效應(yīng)[5-6]。

紐蛋白（vinculin）是一種與黏著類型連接形成有關(guān)的細(xì)胞骨架蛋白，存在于細(xì)胞—細(xì)胞及細(xì)胞—基質(zhì)間的黏著部位，其作用是將 F-actin 錨著于連接點(diǎn)形成部位的細(xì)胞膜上[7]。紐蛋白的表達(dá)對 MSC的黏附功能有著重要作用[8]。

本研究中，我們通過激光共聚焦顯微鏡（laser confocal microscope，LCM）觀察了 E2 作用下細(xì)胞骨架和細(xì)胞連接的情況，用透射電子顯微鏡（transmission electron microscopy，TEM）觀察細(xì)胞內(nèi)部細(xì)胞器的變化，探討 E2 作用后 MSC 功能變化的可能原因。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本來源 自然足月剖腹產(chǎn)的健康胎兒臍帶，獲自南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院。所用材料均嚴(yán)格遵守醫(yī)學(xué)倫理道德，經(jīng)產(chǎn)婦及家屬認(rèn)可，并經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.1.2 主要試劑 DMEM/F12 培養(yǎng)基和優(yōu)級胎牛血清（FBS）購自美國 Gibco 公司；膠原酶 II、中性蛋白酶、透明質(zhì)酸酶購自美國 Sigma 公司；熒光標(biāo)記小鼠抗人抗體 PE-CD117、PE-CD44、PE-CD29、FITC-CD31、FITC-CD45 和 APC-CD105單克隆抗體購自美國 Ebioscience公司；鼠 IgG-PE、鼠抗人紐蛋白單克隆抗體購自美國 Santan 公司；17β-雌二醇、鬼筆環(huán)肽（Phalloidin- FITC）購自美國 Sigma 公司；明膠、牛血清白蛋白（BSA）購自中國 sunshine 公司；聚乙二醇辛基苯基醚（Triton 100）購自中國 beyotime 公司。

1.1.3 儀器 FACSCalibur 流式細(xì)胞儀為美國BD 公司產(chǎn)品；FV10i 型激光共聚焦顯微鏡為日本Olympus 公司產(chǎn)品；Philipscm12 型透射電子顯微鏡為荷蘭 Philips 公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 人臍帶來源間充質(zhì)細(xì)胞的分離及純化 取足月剖腹產(chǎn)胎兒的臍帶，在無菌狀態(tài)下用預(yù)冷的含 0.01%青霉素和鏈霉素的磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗，去掉臍帶內(nèi)血塊。在 DMEM/F12 基本培養(yǎng)基中，將臍動脈剝除，其余部分剪成 2mm3碎塊，250 U/ml 的膠原酶 II、100 U/ml 中性蛋白酶和 10 U/ml 透明質(zhì)酸酶以 1∶1∶1 的比例加入組織中，37℃振蕩消化 3 h 至組織基本消化完全。離心去上清，用基本培養(yǎng)基洗 3 次，再培養(yǎng)于含 10%FBS 的 DMEM/F12 完全培養(yǎng)基中。調(diào)整細(xì)胞密度為1×109個/L，于 37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3～4 d 后，輕輕晃動培養(yǎng)板，全量換液，待細(xì)胞鋪滿度達(dá) 80%左右，用 2.5 g/L 的胰酶消化，常規(guī)傳代。取第3 代細(xì)胞，分析其表面標(biāo)志，確定其為MSC 后用于試驗。

1.2.2 流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞表面標(biāo)志 消化、收集細(xì)胞，PBS 洗滌 2 次，調(diào)整細(xì)胞密度約 1×106個/ml。共 3 例臍帶 MSC，每個標(biāo)記設(shè) 3 復(fù)孔，加入同型對照和相應(yīng)抗體，4℃避光孵育 30min，PBS 洗滌 2 次后上機(jī)檢測。MSC 檢測標(biāo)志為：CD117、CD29、CD31、CD44、CD105 及 CD45。

1.2.3 細(xì)胞爬片及免疫熒光標(biāo)記 將蓋玻片用75%酒精浸泡 30 s，換到 95%酒精浸泡 30 s，燒干蓋玻片。將蓋玻片放到 12 孔培養(yǎng)板里，加覆500 μl 左右 1%的無菌明膠，37℃孵育 2 h，吸去明膠，PBS 洗，5×105個/ml 細(xì)胞懸浮于完全培養(yǎng)基中，每孔加入 1 ml 細(xì)胞懸液，分別加入10-7nmol/L 和 10-8nmol/L 的 E2 處理 12、24 和48 h。對照組相同體系培養(yǎng)，以同體積的 PBS 代替 E2。將細(xì)胞爬片用 4%多聚甲醛固定 30min，PBS洗 3 次，0.1%聚乙二醇辛基苯基醚（Triton 100）室溫處理 15min，PBS 洗 3 次，用 3%牛血清白蛋白（BSA）室溫封閉 1 h，PBS 洗，加一抗鼠抗人紐蛋白單抗，4℃過夜。PBS洗 3 次，分別加抗鼠 IgG-PE 和 Phalloidin-FITC，室溫孵育1 h，PBS洗 3 次，最后 DAPI 染核 10min，PBS洗 3 次，加防熒光猝滅劑封片。

1.2.4 透射電鏡樣品制備 將 E2 處理過的臍帶MSC 200×g離心 5min，用預(yù)冷的 PBS 洗滌2 次，2.5%戊二醛（0.01 mol/L 二甲胂酸鈉配制）固定 4℃過夜。0.01 mol/L 二甲胂酸鈉緩沖液洗滌，l%鋨酸 4℃固定 l h。梯度丙酮脫水，環(huán)氧樹脂 Epon812 包埋，常規(guī)超薄切片，醋酸雙氧鈾及枸櫞酸鉛雙染色后置透射電鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 MSC 的形態(tài)學(xué)觀察和表面標(biāo)記物檢測

原代培養(yǎng)早期細(xì)胞形態(tài)異質(zhì)性較大，以梭形、多角形為主。消化傳代后，從第3 代起開始穩(wěn)定生長，可獲得較均一的 MSC。細(xì)胞形態(tài)為梭形或成纖維樣，體積較大，單核，呈漩渦樣生長（圖1）。流式細(xì)胞儀檢測顯示，臍帶 MSC 穩(wěn)定均一地表達(dá)CD29 和 CD44（纖維蛋白和透明質(zhì)酸鹽的受體，由基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)）、CD105（SH-2）；不表達(dá) CD117（多能造血干細(xì)胞標(biāo)志）、CD31（內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志）和 CD45（造血細(xì)胞標(biāo)志）。經(jīng) 3 代以上傳代后，細(xì)胞成分均一，純度在 95%以上（圖2）。

圖1 人臍帶來源 MSC 的細(xì)胞形態(tài)（A：第2 代；B：第3 代）Figure 1 The morphology of human umbilical cord MSC (A:P2; B: P3)

2.2 LCM 觀察細(xì)胞骨架

正常的臍帶 MSC 細(xì)胞 F-actin Phalloidin-FITC 熒光染色為綠色，呈細(xì)絲狀，主要沿細(xì)胞長軸分布，貫穿整個 MSC 細(xì)胞（圖3A）。Vinculin 免疫染色為紅色，呈點(diǎn)狀，簇狀著染于肌動蛋白兩端，分布于胞漿中細(xì)胞膜側(cè)（圖3B，白色箭頭）。胞漿與細(xì)胞核中見非特異性著染，細(xì)胞核染色為藍(lán)色。10-7nmol/L E2處理 48 h 后，對肌動蛋白分布無太大影響（圖3D），Vinculin 主要分布于胞漿中靠細(xì)胞核側(cè)（圖3E）。10-8nmol/L 組各時間點(diǎn)細(xì)胞形態(tài)及肌動蛋白分布均無明顯變化。

2.3 TEM 觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

圖2 人臍帶 MSC 的表面標(biāo)志（陰影部分為同型對照）Figure 2 The surface marker of human umbilical cord MSC (Shadow area was isotype control)

圖3 E2 作用后 MSC 細(xì)胞骨架的變化（F-actin 著染綠色熒光，白色箭頭指向的紅色亮點(diǎn)為vinculin） （A：對照組 F-actin--FITC 熒光染色；B：對照組 vinculin 熒光染色；C：對照組 F-actin 和 vinculin 染色疊加；D：E2 組 F-actin--FITC 熒光染色；E：E2 組 vinculin 熒光染色；F：E2 組 F-actin 和 vinculin 染色疊加）Figure 3 Changes of cytoskeleton of MSC after E2 treatment [ Cell cytoskeleton proteins F-actin (Green) and vinculin (Red, white arrows showed vinculin) ](A: Control FITC-F-actin; B: Control PE-vinculin; C: A and B overlap; D: E2 FITC-F-actin; E: E2 PE-vinculin; F: D and E overlap)

10-7nmol/L E2 處理 MSC 48 h 后，透射電鏡觀察細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。對照組細(xì)胞核呈圓或卵圓不規(guī)則形，雙層核膜完整，核仁大而明顯，常異染色質(zhì)分布均勻，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體等細(xì)胞器數(shù)量豐富、結(jié)構(gòu)清晰（圖4A、B、C）。E2 處理后的 MSC 透射電鏡下見有部分細(xì)胞開始出現(xiàn)結(jié)構(gòu)異?，F(xiàn)象，有的胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大量大小不等的空泡（圖4D）和自噬體，自噬體內(nèi)含有未被完全消化的殘余細(xì)胞器和胞質(zhì)成分，即髓鞘樣小體（圖4F）。

圖4 E2 作用后 MSC 細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化（箭頭指向細(xì)胞空泡和自噬體） （A：對照組 10 000×；B：對照組 20 000×；C：對照組 40 000×；D：E2 組 10 000×；E：E2 組 20 000×；F：E2 組 40 000×）Figure 4 Changes of ultrastructure of MSC after treated with E2 (Arrows showed vacuoles and autophagosome) (A: Control 10 000×; B: Control 20 000×; C: Control 40 000×; D: Treat with E2 10 000×; E: Treat with E2 20 000×; F: Treat with E2 40 000×)

3 討論

細(xì)胞骨架在細(xì)胞的增殖，維持細(xì)胞形態(tài)、極性、內(nèi)吞作用，胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，細(xì)胞活性，運(yùn)動能力等方面起著重要作用。細(xì)胞骨架包括微管、微絲和中間絲三部分，分別與細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)和脂分子相互連接，成為細(xì)胞運(yùn)動、細(xì)胞形態(tài)和跨膜信息傳遞的基礎(chǔ)。F-actin 呈纖維狀，構(gòu)成細(xì)胞內(nèi)微絲骨架的主要部分，而 Arp2/3 復(fù)合物是構(gòu)成F-actin 的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。微絲的肌動蛋白有兩種存在方式：一種是聚合態(tài)（F-actin），另一種是游離狀態(tài)（G-actin）。當(dāng)細(xì)胞功能活躍時，F(xiàn)-actin 伸長通過其膜上黏著相關(guān)分子（肌動蛋白結(jié)合蛋白）介導(dǎo)，將肌動蛋白連接于細(xì)胞外基質(zhì)，將軸突向此方向拉動。當(dāng)不能與細(xì)胞外基質(zhì)形成黏著類型的連接時，F(xiàn)-actin 解聚。這種解聚和聚合的變化與細(xì)胞的附著、運(yùn)動、形態(tài)及細(xì)胞內(nèi)外的信息傳遞等功能有關(guān)，為細(xì)胞內(nèi)外信息傳遞提供分子橋梁，控制細(xì)胞形態(tài)、運(yùn)動、增殖等生物效應(yīng)[9]。微絲肌動蛋白的聚合和解聚隨著生理和病理條件發(fā)生改變，在本實(shí)驗中，用共聚焦顯微鏡未觀察到 F-actin 在分布和表達(dá)水平的變化。

Vinculin 是一種與黏著類型連接形成有關(guān)的細(xì)胞骨架蛋白，其作用是將 F-actin 錨著于連接點(diǎn)形成部位的細(xì)胞膜上。已有報道，在培養(yǎng)細(xì)胞的胞漿內(nèi)有一紐蛋白池，其與膜聯(lián)的紐蛋白間形成動力學(xué)平衡[3-4]。通過這種平衡，來控制細(xì)胞的形態(tài)和運(yùn)動能力。目前關(guān)于點(diǎn)狀連接部位紐蛋白分布及作用的報道很多，但關(guān)于胞漿內(nèi)紐蛋白池在細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的分布，至今未見報道。本實(shí)驗結(jié)果表明，正常情況下紐蛋白在靠近細(xì)胞膜側(cè)分布，認(rèn)為是細(xì)胞與培養(yǎng)基質(zhì)間形成黏著連接的部位，而胞漿內(nèi)的紐蛋白呈均勻的網(wǎng)格狀分布，可能與微絲的分布相關(guān)。而經(jīng) E2 處理后，紐蛋白主要分布于胞漿中靠細(xì)胞核側(cè)。這種變化可能導(dǎo)致胞漿內(nèi)紐蛋白池與膜聯(lián)的紐蛋白間動力學(xué)失衡。從而影響 MSC 的運(yùn)動和趨化至病理部位的能力。

細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)顯示了細(xì)胞中細(xì)胞器的形態(tài)、數(shù)量的變化，從而揭示了細(xì)胞的分裂、衰老和凋亡情況。透射電鏡的結(jié)果表明，正常 MSC 超微結(jié)構(gòu)良好，細(xì)胞器較豐富，有完成最基本細(xì)胞功能的細(xì)胞器，如線粒體、核糖體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等。E2 處理后，MSC 超微結(jié)構(gòu)則明顯出現(xiàn)了衰老和凋亡特征：細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)了大量空泡（可能來源于線粒體腫脹變性），周圍出現(xiàn)雙層膜空泡結(jié)構(gòu)，繼而雙層膜環(huán)繞成自噬體，進(jìn)而與溶酶體融合、消化，形成自噬體不能消化的殘體。這些變化表明細(xì)胞的蛋白合成和有氧呼吸功能受到影響，大量細(xì)胞內(nèi)具有較多的自噬體和消化未盡的髓鞘樣小體，表明這些細(xì)胞可能出現(xiàn)衰老現(xiàn)象，而其自身已經(jīng)開始了自我保護(hù)性反應(yīng)。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體數(shù)量反而增加，可能是細(xì)胞為了維持平衡出現(xiàn)的代償性增加。樸英杰等[10]首次提出了細(xì)胞自噬性凋亡的概念，闡明其為一種細(xì)胞自我保護(hù)反應(yīng)。當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入衰老階段或功能異常時，也可通過細(xì)胞凋亡來結(jié)束自身的生命。我們觀察到的細(xì)胞中也有自噬性凋亡現(xiàn)象的發(fā)生?？傊珽2 存在的情況下，MSC 的超微結(jié)構(gòu)和細(xì)胞骨架發(fā)生異常，這種異常可能與 E2 作用下 MSC的增殖、凋亡、貼壁以及遷移能力的變化有關(guān)。

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