周 琳，張連峰，李偉芳，史成章

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化科，河南鄭州450052

由于早期診斷率低，多數(shù)胰腺癌在診斷時(shí)已處于中晚期，能夠手術(shù)切除的病例不足10%［1］。近年來(lái)聯(lián)合應(yīng)用化學(xué)治療和分子靶向藥物治療日益受到人們的關(guān)注。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶Ⅱ(ACE2)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)新成員。新近的一些研究證實(shí)ACE2的表達(dá)缺失可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，而且初步證實(shí)ACE2可能是一個(gè)抑癌基因［2］。我們先前的研究發(fā)現(xiàn)胰腺癌組織中存在ACE2表達(dá)下調(diào)甚至缺失，且 ACE2可抑制胰腺癌細(xì)胞增殖，提示ACE2功能缺失參與了胰腺癌的發(fā)病過(guò)程［3］。本研究通過(guò)建立穩(wěn)定高表達(dá)ACE2的胰腺癌細(xì)胞株，旨在探討ACE2在體外對(duì)胰腺癌細(xì)胞化學(xué)治療敏感性的影響，并初步探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng) 人胰腺癌細(xì)胞株SW1990購(gòu)自中科院上海細(xì)胞生物研究所，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)，在37℃、5%CO2飽和濕度條件下傳代培養(yǎng)，每天換液以保證細(xì)胞濃度維持在(2～4)×105的最佳生長(zhǎng)狀態(tài)，臺(tái)盼藍(lán)檢測(cè)細(xì)胞活力＞90%，選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。吉西他濱(美國(guó)Lilly公司)溶解于無(wú)菌PBS中，制備為100 μmol/L儲(chǔ)備溶液，4℃保存。

1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 ACE2表達(dá)質(zhì)粒(pReceiver-M02-ACE2)與空白對(duì)照質(zhì)粒(pReceiver-M02-GFP)由課題組前期構(gòu)建。按照Polifect轉(zhuǎn)染試劑盒(美國(guó)Qiagen公司)說(shuō)明書(shū)操作，具體方法:轉(zhuǎn)染前一天將3×105細(xì)胞接種到6孔板中。轉(zhuǎn)染時(shí)將ACE2質(zhì)粒和對(duì)照質(zhì)粒DNA 各 0.4 μg/孔和 10 μL Polifect轉(zhuǎn)染試劑混合，加入500 μL/孔Optimen無(wú)血清培養(yǎng)液，孵育4 h，之后更換為完全培養(yǎng)液，細(xì)胞在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。

1.3 建立穩(wěn)定高表達(dá)ACE2基因細(xì)胞株 細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后換液，48 h后加入400 μg/mL G418的細(xì)胞培養(yǎng)液，篩選克隆;4周后，待穩(wěn)定轉(zhuǎn)染ACE2及空白對(duì)照質(zhì)粒的SW1990細(xì)胞克隆形成后，挑取克隆(分別命名為SW1990/ACE2和SW1990/GFP)，培養(yǎng)在含200 μg/mL G418的培養(yǎng)液中維持生長(zhǎng)和傳代。

1.4 Western印跡 細(xì)胞離心沉淀后加入裂解液(RIPA，上海申能博采)，RC-DC法蛋白定量(美國(guó)Bio-Rad公司)。取30 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜(Bio-Rad公司)，先后與特異性抗ACE2多克隆抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)和抗β-actin單克隆抗體(美國(guó)Sigma公司)、辣根過(guò)氧化物酶連接的二抗(Santa Cruz公司)孵育，ECL(Amersham Biosciences公司)顯影。

1.5 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率 使用CCK-8試劑盒(日本Dojindo公司)，通過(guò)檢測(cè)WST-8的剪切水平(OD450吸光值)觀察ACE2對(duì)細(xì)胞增殖的影響，具體方法如下:取未轉(zhuǎn)染組、陰性對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組的SW1990細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。將5×103細(xì)胞接種于96孔板，每組細(xì)胞分別給予10、20、50 μmol/L濃度的吉西他濱干預(yù)24 h，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，每孔加入100 μL培養(yǎng)液。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μL CCK-8試劑，繼續(xù)孵育4 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定溶液在450 nm處的吸光度。增殖抑制率(%)=(1-處理孔A 450 nm/對(duì)照孔A 450 nm)×100%。

1.6 胰腺癌細(xì)胞的凋亡檢測(cè)

1.6.1 細(xì)胞凋亡的TUNEL法檢測(cè):使用Roche公司的TUNEL試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡。收集各組細(xì)胞，按5×103/孔接種于含小玻片的6孔板內(nèi)，每組細(xì)胞分別給予50 μmol/L濃度的吉西他濱干預(yù)，每組設(shè)3復(fù)孔，孵育48 h，取出玻片，PBS輕洗后，按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，DAB染色。凋亡細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞核綠色熒光。選擇隨機(jī)5個(gè)40×視野，凋亡率(%)=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.6.2 流式細(xì)胞儀:每組細(xì)胞分別給予50 μmol/L濃度的吉西他濱處理48 h，收集細(xì)胞于1.5 mL離心管中，用加冰預(yù)冷的PBS洗2次，以少量PBS懸浮細(xì)胞，細(xì)胞濃度為1×106/mL。取100 μL細(xì)胞懸液加入5 μL膜聯(lián)蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素(AnnexinⅤ-FITC)、100 μg 碘化丙啶(PI，250 μg/mL，Sigma 公司)室溫避光反應(yīng)30 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，多組間均值的兩兩比較采用SNK法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ACE2在胰腺癌細(xì)胞中的表達(dá) Western印跡結(jié)果顯示，ACE2蛋白在SW1990和SW1990/GFP細(xì)胞中均有微弱表達(dá)，在SW1990/ACE2細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯強(qiáng)于陰性對(duì)照及未處理組(見(jiàn)圖1)。取ACE2灰度/β-actin灰度比值得出ACE2相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度，結(jié)果顯示在蛋白水平，SW1990、SW1990/GFP和 SW1990/ACE2的 ACE2值分別為 0.231±0.041、0.216±0.033、0.865±0.162，SW1990/ACE2中 ACE2蛋白水平明顯高于SW1990和SW1990/GFP(P＜0.05)。上述結(jié)果證明穩(wěn)定高表達(dá)ACE2的胰腺癌細(xì)胞株構(gòu)建成功。

圖1 不同處理組SW1990細(xì)胞中ACE2蛋白的表達(dá) A:SW1990;B:SW1990/GFP;C:SW1990/ACE2Fig 1 Western blot analysis showing expression of ACE2 in SW1990 cells after they had been infected with an adenovirus containing

2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率 不同濃度(10、20、50 μmol/L)吉西他濱干預(yù)3種細(xì)胞24 h，細(xì)胞增殖抑制率呈劑量依賴性增高。SW1990/ACE2分別為(19.6±2.7)%、(29.3±4.2)%和(51.2±4.8)%，SW1990/GFP分別為(11.1±1.3)%、(15.2±1.6)%和(24.2±3.3)%，SW1990細(xì)胞分別為(12.6±1.7)%、(17.7±1.4)%和(21.3±2.6)%。在各個(gè)濃度階段，吉西他濱對(duì)SW1990/ACE2細(xì)胞抑制率均明顯高于ACE2和ACE2/GFP細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。SW1990和SW1990/GFP間細(xì)胞抑制率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。表明穩(wěn)定過(guò)表達(dá)ACE2可增加胰腺癌細(xì)胞對(duì)吉西他濱的敏感性。

2.3 胰腺癌細(xì)胞凋亡檢測(cè)

2.3.1 TUNEL法:吉西他濱(50 μmol/L)干預(yù)24 h后，SW1990/ACE2凋亡率達(dá)(17±2)%，明顯高于SW1990(8±1)%和SW1990/GFP(11±3)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。統(tǒng)計(jì)分析表明轉(zhuǎn)染ACE2表達(dá)質(zhì)粒后，SW1990細(xì)胞的凋亡率升高(見(jiàn)圖2)。

圖2 TUNEL檢測(cè)吉西他濱干預(yù)24 h后實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的凋亡，凋亡細(xì)胞核斷端被原位特異標(biāo)記(40×)Fig 2 Analysis of apoptosis using TUNEL in SW1990 pancreatic cancer cells stably expressed ACE2 after treatment with gemcitabin for 24 h.DNA fragmentation were detected by labeling the terminal end of nucleic acids(40×)

2.3.2 流式細(xì)胞儀雙染法檢測(cè):吉西他濱(50 μmol/L)干預(yù)24 h后，SW1990/ACE2凋亡率達(dá)(31.2±3.8)%，與 SW1990和 SW1990/GFP比較［(17.6±2.3)%和(15.9±1.7)%］差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);SW1990和SW1990/GFP比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。表明ACE2可增加吉西他濱誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞的凋亡率。

3 討論

盡管目前胰腺癌的治療仍以手術(shù)為主，但由于切除率低下且預(yù)后不佳，以化學(xué)治療為基礎(chǔ)的綜合治療已成為中晚期胰腺癌治療的最佳方案。吉西他濱是抗進(jìn)展期胰腺癌化學(xué)治療的一線藥物，可作用于DNA合成期的腫瘤細(xì)胞，即S期細(xì)胞，在一定條件下阻止其從G1期向S期進(jìn)展［4］。吉西他濱在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化成吉西他濱磷酸鹽，后者可使DNA鏈合成停止，進(jìn)而DNA斷裂、細(xì)胞死亡，發(fā)揮抗癌作用。

ACE2作為腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)新成員，是目前發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)，也是唯一一個(gè) ACE的同工酶［5］。人類 ACE2的基因定位于 Xp22，基因全長(zhǎng)39.98 kb，由18個(gè)外顯子和20個(gè)內(nèi)含子組成，蛋白分子量為92.5 KD。ACE2廣泛分布于人體的各個(gè)組織，在心臟、腎臟、睪丸、胃腸道和肺臟等部位都有表達(dá)。ACE2通過(guò)水解AngⅠ羧基端脯氨酸與苯丙氨酸之間的肽鍵，生成Ang-(1-7)，Ang-(1-7)通過(guò)其特異性Mas受體及與激肽系統(tǒng)的交互作用發(fā)揮其拮抗AngⅡ的作用。與ACE有所不同，ACE2具有舒張血管平滑肌的抗高血壓作用。由于ACE2可削弱甚至拮抗AngⅡ促進(jìn)細(xì)胞增殖的效應(yīng)，近年來(lái)其在腫瘤細(xì)胞中的生物學(xué)效應(yīng)日漸受到關(guān)注。Feng等將ACE2表達(dá)載體轉(zhuǎn)染非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ACE2可抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)(VEGF)及肺癌細(xì)胞的增殖［2］。我們已完成的研究發(fā)現(xiàn):與癌旁正常胰腺組織標(biāo)本的胰腺導(dǎo)管細(xì)胞相比，導(dǎo)管癌細(xì)胞中ACE2蛋白僅有微弱表達(dá);進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)小干擾RNA技術(shù)封閉胰腺癌細(xì)胞株中ACE2的表達(dá)后，胰腺癌細(xì)胞的增殖明顯加強(qiáng)［3］。以上結(jié)果提示，ACE2在不同種類的癌細(xì)胞中均可抑制其異常增殖，胰腺癌中存在著因ACE2下調(diào)導(dǎo)致的功能缺失。

在吉西他濱作用下，SW1990/ACE2組細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用強(qiáng)于其他兩組，且各組細(xì)胞對(duì)藥物引起的生長(zhǎng)抑制作用有明顯的劑量依賴性。近年來(lái)的研究表明，多種抗腫瘤藥物均可導(dǎo)致不同程度的細(xì)胞凋亡，細(xì)胞的增殖、分化、凋亡三者間的平衡失調(diào)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。國(guó)外的一些研究提示，吉西他濱可通過(guò)線粒體依賴的通路誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡［6］。在本實(shí)驗(yàn)中，我們通過(guò)TUNEL法和流式雙染AnnexinⅤ/PI法檢測(cè)到ACE2可誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞的凋亡，且吉西他濱誘導(dǎo)SW1990/ACE2細(xì)胞凋亡的作用最強(qiáng)，提示穩(wěn)定高表達(dá)ACE2的胰腺癌細(xì)胞對(duì)吉西他濱的敏感性增強(qiáng)，兩者有聯(lián)合作用。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ACE2和吉西他濱在體外聯(lián)合作用于SW1990細(xì)胞，無(wú)論在抑制細(xì)胞的增殖方面，還是誘導(dǎo)凋亡方面，均有明顯的協(xié)同作用。

綜上所述，本研究顯示ACE2可明顯增強(qiáng)吉西他濱對(duì)胰腺癌細(xì)胞對(duì)化學(xué)治療的敏感性，其機(jī)制涉及抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等多個(gè)方面，為基因和化學(xué)藥物的聯(lián)合治療提供新的思路。ACE2有望成為胰腺癌治療的靶點(diǎn)，值得進(jìn)一步深入探討。

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