趙 剛，韋 輝，吳貴華

(1.天津市武清區(qū)藥品檢驗(yàn)所，天津 301700； 2.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193； 3.天津市藥品檢驗(yàn)所，天津 300070)

金匱腎氣丸是由地黃、山藥、山茱萸(酒炙)等共10味藥材組成的大蜜丸,具有溫補(bǔ)腎陽，行氣行水之功效。處方中山茱萸(酒炙)可補(bǔ)益肝腎，馬錢苷是山茱萸主要有效成分之一。采用HPLC法測(cè)定金匱腎氣丸中馬錢苷含量可用作金匱腎氣丸質(zhì)量控制，并可對(duì)生產(chǎn)中使用的山茱萸(酒炙)藥材質(zhì)量提供客觀評(píng)價(jià)。

1 儀器與試藥

日本SHIMADZU LC-20AD高效液相色譜儀，二極管陣列檢測(cè)器，LC solution工作站。馬錢苷對(duì)照品(中國藥品生物制品檢定所提供，批號(hào)111640-200503)，金匱腎氣丸(天津市某藥品生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)，批號(hào)144447、144448、144449)。四氫呋喃、乙腈、甲醇(色譜純，天津市康科德科技有限公司)，磷酸(化學(xué)純，天津市化學(xué)試劑廠)，水為去離子水。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 色譜柱為Agilent Zorbax Sb- C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；以四氫呋喃-甲醇-乙腈-水(1∶7∶4∶88)為流動(dòng)相A，乙腈為流動(dòng)相B，按表1進(jìn)行洗脫。檢測(cè)波長為236 nm，柱溫35 ℃ ，流速1 ml/min。理論板數(shù)按馬錢苷峰計(jì)算應(yīng)不低于5 000。

表1 馬錢苷梯度洗脫系統(tǒng)

2.2溶液制備

2.2.1對(duì)照品溶液的制備 取馬錢苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 ml含15 μg的溶液，即得。

2.2.2供試品溶液的制備 取“重量差異”項(xiàng)下的樣品，剪碎，取約1.5 g，精密稱定，精密加入甲醇25 ml，稱定重量，加熱回流2 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，濾過，取續(xù)濾液，搖勻，即得。

2.2.3陰性樣品溶液的制備 按處方取除酒茱萸的各味藥材，按制備工藝制得丸劑樣品，再按“2.2.2”供試品溶液制備方法，制得陰性樣品溶液。

2.3陰性對(duì)照試驗(yàn) 分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液各10 μl，注入高效液相色譜儀中，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分析。結(jié)果陰性樣品在馬錢苷色譜峰對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間無干擾。見圖1。

2.4線性關(guān)系考查 取馬錢苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 ml含0.006 216、0.010 36、0.020 72、0.031 08、0.051 80和0.103 6 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液，分別精密吸取上述不同濃度的對(duì)照品溶液各10 μl，分別注入高效液相色譜儀中，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件分析，測(cè)定各自峰面積，以對(duì)照品進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積值為縱坐標(biāo)，求得回歸方程：Y=1.601 821 19×106X-5.789 397 8×103(r=0.999 99)。結(jié)果表明馬錢苷在0.062 16～1.036 00 μg范圍內(nèi)線性良好。

2.5進(jìn)樣精密度試驗(yàn) 取批號(hào)為144447的樣品1份，按 “2.2.2”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得樣品中馬錢苷峰面積值分別為179 093、177 644、179 383、180 013、172 941、179 212，峰面積平均值為178 048；峰面積的RSD為1.47%。

2.6重復(fù)性試驗(yàn) 取批號(hào)為144447的樣品，共6份，按 “2.2.2”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，測(cè)定每份樣品中馬錢苷含量。分別為0.187 0、0.185 1、0.189 0、0.186 5、0.187 6、0.188 2 mg/g。馬錢苷平均含量為0.187 2 mg/g，RSD為0.7%，表明本方法重復(fù)性良好。

1. 馬錢苷

2.7穩(wěn)定性試驗(yàn) 取批號(hào)為144447的樣品1份，按 “2.2.2.”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別在0、3、6、9、12、15 h，測(cè)定樣品中馬錢苷峰面積。峰面積值分別為 179 093、180 013、177 417、180 069、178 751、178 936。測(cè)得峰面積平均值為179 047， RSD為0.5%， 表明供試品溶液最少在15 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8回收率試驗(yàn) 取批號(hào)為144447的樣品，剪碎，取約0.75 g，共6份，精密稱定，分別精密加入馬錢苷對(duì)照品甲醇溶液(0.031 08 mg/ml)5 ml，精密加入甲醇20 ml，再按照“2.2.2”供試品溶液制備操作，制得供回收率用供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分析，計(jì)算回收率，結(jié)果平均回收率為101.9%，RSD為1.77%。見表2。

2.9樣品含量測(cè)定 取3個(gè)批號(hào)(144447、144448、144449)的樣品，按照“2.2.2”項(xiàng)下制成供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分析，測(cè)定樣品中馬錢苷含量。結(jié)果分別為0.186 1、0.196 0、0.186 5 mg/g(n=2)。

表2 加樣回收試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1流動(dòng)相的選擇 參考相關(guān)文獻(xiàn)[1]并結(jié)合本品的特點(diǎn)，對(duì)乙腈-水(15∶85)、(10∶90)、(9∶91)，乙睛-0.05%磷酸(9∶91)、(11∶89)，四氫呋喃-甲醇-乙腈-水(1∶7∶4∶88)、(1∶4∶4∶91)等進(jìn)行選擇。因本品含各類色譜雜質(zhì)峰較多，馬錢苷色譜峰出峰時(shí)間太早，不能達(dá)到基線分離，并有小雜質(zhì)峰的干擾，對(duì)測(cè)定結(jié)果有影響，選擇馬錢苷色譜峰保留時(shí)間在30 min左右時(shí)，分離效果最好。結(jié)果選擇四氫呋喃-甲醇-乙腈-水(1∶7∶4∶88)作為本方法的流動(dòng)相。因在80 min后仍有較多色譜峰出現(xiàn)，采用梯度洗脫的辦法，可去除其他色譜峰的影響，縮短分析時(shí)間，馬錢苷色譜峰可達(dá)到基線分離，分離度符合要求。

3.2提取方法的選擇

3.2.1提取溶劑 取批號(hào)為144447的樣品，剪碎，取約1.5 g，精密稱定，分別用甲醇、70%甲醇、50%甲醇25 ml作為溶劑，加熱回流60 min，分別測(cè)定樣品中馬錢苷含量。不同溶劑提取的含量測(cè)定結(jié)果平均值為0.185 2 mg/g，其RSD為0.91%，無顯著差別。用甲醇提取的結(jié)果含量最高，試驗(yàn)操作便利，故本試驗(yàn)方法采用甲醇為提取溶劑。

3.2.2提取方式 取批號(hào)為144447的樣品，剪碎，取約1.5 g，精密稱定，分別精密加入甲醇25 ml，稱定重量，超聲處理或加熱回流60 min，放冷，再稱定重量，分別用甲醇補(bǔ)足減失的重量，濾過，取續(xù)濾液，測(cè)定樣品中馬錢苷含量分別為0.180 4、0.186 1 mg/g(n=2)。4份測(cè)定結(jié)果RSD為2.1%，說明采用超聲處理和加熱回流兩種提取方式，測(cè)定結(jié)果基本相同，加熱回流提取測(cè)定結(jié)果較高，故選擇加熱回流為樣品的提取方式。

3.2.3提取時(shí)間 取批號(hào)為144447的樣品，剪碎，取約1.5 g，精密稱定，精密加入甲醇25 ml，稱定重量，分別加熱回流40、60、120和160 min，放冷，再稱定各自重量，用甲醇補(bǔ)足減失各自的重量，濾過，取續(xù)濾液，測(cè)定樣品中馬錢苷的含量。分別為0.186 2、0.186 1、0.191 2、0.188 8 mg/g(n=2)，RSD為1.3%。測(cè)定結(jié)果顯示，提取時(shí)間為40～160 min，其含量測(cè)定結(jié)果無明顯差異。本試驗(yàn)方法選定加熱回流時(shí)間為120 min。

3.3耐用性試驗(yàn) 取批號(hào)為144447的樣品，按 “2.2.2”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，分別使用Agilent Zorbax Sb- C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm)色譜柱； Sepax Sappire C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱和Diamonsil - C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，測(cè)定樣品中馬錢苷含量。結(jié)果顯示，采用三種不同色譜柱測(cè)定的結(jié)果分別為0.186 1、0.190 2和0.183 9 mg/g，平均值為0.186 7 mg/g，RSD為1.71%，無明顯差別，表明該含量測(cè)定方法耐受性良好，具有可行性。

1 中國藥典.一部.2010：597-602