姚建波，吳志軍，陳志寶

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶 163319）

原生質(zhì)體融合是近年來迅速發(fā)展的一項(xiàng)有效的育種技術(shù)，通過細(xì)胞內(nèi)染色體遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移實(shí)現(xiàn)基因重組[1-2]。該技術(shù)首先通過酶解作用除去細(xì)胞壁，使細(xì)胞成為原生質(zhì)體，然后利用物理、化學(xué)或生物手段將兩種不同親株的原生質(zhì)體融合，使細(xì)胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)發(fā)生重組交換，并經(jīng)篩選獲得集雙親優(yōu)良性狀于一體的穩(wěn)定融合子[3]。原生質(zhì)體融合技術(shù)與傳統(tǒng)的誘變技術(shù)相結(jié)合，極大地促進(jìn)了微生物育種技術(shù)的提高?；谠|(zhì)體融合的基因組重排技術(shù)[4]在育種領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用[5-6]。

中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)（Central Composite Design，CCD）[7]采用科學(xué)的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，可以減少試驗(yàn)次數(shù)并且提高了試驗(yàn)的精密度。響應(yīng)面分析方法（Response Surface Methodology）[8]是將統(tǒng)計(jì)學(xué)與數(shù)學(xué)相結(jié)合一種有效的的手段，在微生物、化工、食品、工程等方面有廣泛的應(yīng)用[9-10]。T.Suzuki等人[11]通過析因設(shè)計(jì)探索了三個(gè)不同的因素對（變形桿菌）Prototheca zopfii原生質(zhì)體制備條件的影響。Muralidhar等人[12]利用響應(yīng)面設(shè)計(jì)方法對影響灰黃青霉（Penicillium griseofulvum）原生質(zhì)體的因素進(jìn)行了優(yōu)化，獲得了制備其原生質(zhì)體的最佳條件。Deb等人[13]利用溶菌酶除去枯草芽孢桿菌細(xì)胞壁的方法，制備了枯草芽孢桿菌原生質(zhì)體，并通過原生質(zhì)體融合的方法，獲得了產(chǎn)木聚糖酶的融合子。

通過中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析的方法對影響枯草芽孢桿菌BS-1101原生質(zhì)體形成的關(guān)鍵因素進(jìn)行優(yōu)化，為原生質(zhì)體融合育種方法和基因組重排技術(shù)提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌種

枯草芽孢菌BS-1101：本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，NaCl 10 g，瓊脂 20 g，加 H2O 定容至 1000 mL，pH7.2，121 ℃滅菌15 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基成分：葡萄糖20 g，蛋白胨2 g，Na2HPO44 g，KH2PO42 g，MgSO40.5 g，營養(yǎng)瓊脂 45 g，加水定容至1000 mL，pH7.2，121℃滅菌15 min。

1.1.3 試劑

溶菌酶（BR）：上海生化所

高滲緩沖溶液：稱取5.96 g KCl溶于100 mL、pH8.0的磷酸緩沖液中，形成0.8 moL·L-1的高滲緩沖液。

溶菌酶溶液：稱取20.0 mg溶菌酶溶于1 mL高滲緩沖液中，0.2 μm過濾除菌。稀釋得到不同濃度的溶菌酶溶液。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)方法

從LB培養(yǎng)基固體斜面挑取一環(huán)接入含50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，37℃恒溫培養(yǎng)箱活化12 h，以5%接種量接入50 mL新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃、170 rpm恒溫振蕩培養(yǎng)8 h進(jìn)入對數(shù)期。

1.2.2 原生質(zhì)體制備方法[14]

取收集適量對數(shù)期菌液，3500 r·min-1條件下離心10 min。棄去上清液，保留菌絲體。用磷酸緩沖液洗滌離心2次，待用。按照CCD試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案用不同的條件的溶菌酶高滲溶液處理一定時(shí)間制備原生質(zhì)體。用去離子水稀釋、涂布于發(fā)酵固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)36 h，用菌落計(jì)數(shù)法計(jì)算原生質(zhì)體制備率。

A為溶菌酶處理前培養(yǎng)基上的菌落數(shù)；B為溶菌酶處理后培養(yǎng)基上的菌落數(shù)；

1.2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)選取原生質(zhì)體制備過程中的酶解溫度（X1）、溶菌酶濃度（X2）、酶解時(shí)間（X3）三個(gè)因素進(jìn)行考察。對不同因素所選用的水平進(jìn)行編碼，如表1所示：

表1 響應(yīng)面分析因素及水平Table 1 Variables and their levels for CCD

按照中心組合試驗(yàn)的設(shè)計(jì)方案，以原生質(zhì)體制備率（%）為目標(biāo)，選取3因素5水平的20組試驗(yàn)設(shè)計(jì)（表2）。利用Design-Expert7.0.0軟件作出響應(yīng)面圖和等高線圖，并對試驗(yàn)結(jié)果結(jié)果進(jìn)行二次回歸分析，得到帶有交互作用和平方項(xiàng)的回歸方程。對模型進(jìn)行方差分析，找出原生質(zhì)體的最佳制備條件，并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

2 結(jié)果與討論

2.1 CCD試驗(yàn)結(jié)果

中心組合試驗(yàn)共20次試驗(yàn)，結(jié)果見表2，利用Design-Expert7.0.0對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析并建立二次模型，方差分析結(jié)果見表3所示。

表2 CCD試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 CCD matrix of three variables with experimental values of yield of protoplast

表3 CCD試驗(yàn)設(shè)計(jì)方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance（ANOVA）for the CCD experimental results

對表2結(jié)果進(jìn)行分析得到如下的二次回歸模型為：

R=74.5+3.86A+5.91B-0.241C+0.650AB-1.42AC+0.450BC-7.86A2-5.28B2-4.82C2

從表3可以看出，在選擇的試驗(yàn)范圍內(nèi)，該模型顯著，失擬項(xiàng)不顯著，決定系數(shù)R2=0.970說明該模型擬合效果良好，從表3還可以看出，酶解溫度（X1）、酶濃度（X2）的一次項(xiàng)及三個(gè)因素的平方項(xiàng)都對提取率有顯著影響，它們之間的交互作用則不顯著。這些也可以從3維響應(yīng)面圖和等高線圖（圖1～圖3）中看出。

2.2 最佳制備條件的優(yōu)化

根據(jù)回歸方程，求得最佳制備條件為：X1=0.272；X2=0.576；X3=-0.0391。在此條件下，通過模型預(yù)測出最佳制備率為76.7%，實(shí)際條件為：酶解溫度37.27℃；酶濃度為5.152 mg·mL-1；酶解時(shí)間88.8 min。通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，在此條件下，得到最優(yōu)制備率為77.02%，與模型預(yù)測的最大值非常接近，說明該模型能很好的解釋枯草芽孢桿菌BS-1101原生質(zhì)體實(shí)際制備情況。

圖1 酶濃度與酶解溫度對提取率的3維響應(yīng)面圖與等高線圖Fig.1 Effects of temperature and enzyme concentration on the protoplast yield

圖2 酶濃度與酶解時(shí)間對提取率的3維響應(yīng)面圖與等高線圖Fig.2 Enzyme concentration and contact time on the protoplast yield

圖3 酶解溫度與酶解時(shí)間對提取率的3維響應(yīng)面圖與等高線圖Fig.3 Effects of temperature and contact time on the protoplast yield

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)以枯草芽孢桿菌BS-1101原生質(zhì)體的制備率為考察對象，利用中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)與響應(yīng)面分析方法相結(jié)合，優(yōu)化了枯草芽孢桿菌BS-1101的原生質(zhì)體制備條件，原生質(zhì)體的制備率達(dá)到77.02%，實(shí)驗(yàn)值與模型預(yù)測的結(jié)果吻合良好，說明響應(yīng)面法是提高原生質(zhì)體制備率的有效途徑，為進(jìn)一步進(jìn)行原生質(zhì)體融合與基因組重排奠定了基礎(chǔ)。

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