腫節(jié)風(fēng)總黃酮對(duì)阿糖胞苷誘發(fā)小鼠S180血小板減少模型的影響

章武強(qiáng) ，蘇 敏 ，陳 奇

1.江西省兒童醫(yī)院急診室，江西 南昌 330006；2.陜西宏府怡悅制藥有限公司新藥部，陜西 西安 710065；3.江西中醫(yī)學(xué)院藥理教研室，江西 南昌 330006

腫節(jié)風(fēng)為金粟蘭科多年生草本植物草珊瑚Sarcandraglabra（Thunb.）Nakai的地上部分或干燥全草，又名草珊瑚。具有活血化瘀，消腫散結(jié)，涼血止血功能，臨床用于血熱妄行，皮膚紫斑，原發(fā)性及繼發(fā)性血小板減少性紫癜，收載于《中國(guó)藥典》2010年版。鐘立業(yè)等[1-2]曾進(jìn)行了腫節(jié)風(fēng)對(duì)大劑量化療后小鼠血小板減少的防治作用的研究，結(jié)果證實(shí)腫節(jié)風(fēng)具有對(duì)抗大劑量5-氟尿嘧啶所造成的血小板減少的作用，可預(yù)防并治療化療后血小板減少癥的發(fā)生。徐國(guó)良等[3]曾報(bào)道腫節(jié)風(fēng)分離總黃酮部位為抗免疫性血小板減少性紫癜的有效成分。以往研究都是以正常健康小鼠為研究對(duì)象，尚未有人以荷瘤小鼠為研究對(duì)象，觀察其對(duì)血小板減少的影響。本文以腫節(jié)風(fēng)浸膏經(jīng)大孔樹(shù)脂分離提純所得的總黃酮[4-5]為實(shí)驗(yàn)藥品，研究其對(duì)阿糖胞苷化療后小鼠肉瘤S180造成的血小板減少作用。

1 資料與方法

1.1 藥品及試劑

碘伏，75%酒精，苦味酸，乙二胺四乙酸鈉（Na2-EDTA·2H2O，150g/L），0.9%氯化鈉注射液，阿糖胞苷（Ara-C，50 mg/支），臨用前用0.9%氯化鈉注射液配成10 mg/ml及5 mg/ml，腫節(jié)風(fēng)總黃酮（ZJF，使用前用蒸餾水配制成所需濃度）。

1.2 動(dòng)物

昆明種小白鼠，5～8周齡，體重20～22 g，雌雄各半，由江西南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院提供，小鼠肉瘤S180由浙江醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院提供。

1.3 器材

超凈工作臺(tái)[SANYOMCV-B161S（T）]，手術(shù)刀、手術(shù)剪、鑷子，注射器，50 ml錐形瓶，酒精燈，灌胃針頭，電子天平（上海天平儀器廠），電熱恒溫真空干燥箱（D2-88，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠），血球儀（Swellab Autocounter 900+）。

1.4 荷瘤小鼠血小板減少模型的建立[6]

1.4.1 接種 將腹腔接種肉瘤S180細(xì)胞后一周的昆明種小白鼠頸椎脫臼處死，用碘伏、75%乙醇腹部局部消毒，在無(wú)菌條件下取出腹水，與生理鹽水1∶3稀釋，給每只小鼠腋窩皮下準(zhǔn)確接種瘤液0.2 ml。

1.4.2 分組給藥 ①接種后24 h分組，每組11只動(dòng)物，實(shí)驗(yàn)共分3組，陰性對(duì)照組（0.2 ml/10 g），阿糖胞苷高劑量組[200 mg/（kg·d）]，阿糖胞苷低劑量組[100 mg/（kg·d）]。 用苦味酸作標(biāo)記，阿糖胞苷高劑量組腹腔注射200 mg/kg，阿糖胞苷低劑量組腹腔注射 100 mg/kg，1次/d，連續(xù)2 d，第3天開(kāi)始阿糖胞苷高劑量組和低劑量組都改用50 mg/kg作為維持劑量繼續(xù)腹腔注射，1次/d，連續(xù)3 d。誘導(dǎo)時(shí)間為5 d，陰性對(duì)照組每天注射同體積的生理鹽水，以造模組血小板下降了陰性對(duì)照組血小板記數(shù)的20%～30%為造模成功的標(biāo)準(zhǔn)。②50只接種成功的荷瘤小鼠，24 h后按體重隨機(jī)分為5組，分別為陰性對(duì)照組，阿糖胞苷組，阿糖胞苷+腫節(jié)風(fēng)總黃酮（150 mg/kg），阿糖胞苷+腫節(jié)風(fēng)總黃酮（200 mg/kg），阿糖胞苷+腫節(jié)風(fēng)總黃酮（250 mg/kg）5組。除陰性對(duì)照組外，其余每組于分組后腹腔注射給予阿糖胞苷100 mg/kg，連續(xù)2 d，第3天改用50 mg/kg作為維持劑量繼續(xù)腹腔注射，1次/d，連續(xù)3 d。誘導(dǎo)時(shí)間為5 d。后三組灌胃給腫節(jié)風(fēng)總黃酮，1次/d，連續(xù)10 d，于第11天處死。

1.5 觀察指標(biāo)

外周血象檢測(cè)：以阿糖胞苷為對(duì)照組的荷瘤小鼠，在造模后第3、5、7、10天于眼眶后靜脈叢取2滴血于加Na2-EDTA·2H2O已干燥的試管中，用手指彈試管，使血盡量與Na2-EDTA·2H2O接觸，1 h內(nèi)用全自動(dòng)血球儀檢測(cè)，觀察血小板數(shù)（PLT）、白細(xì)胞數(shù)（WBC）、紅細(xì)胞數(shù)（RBC）、血紅蛋白含量（HGB）的變化。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組比較，采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 阿糖胞苷對(duì)外周血白細(xì)胞數(shù)（WBC）的影響

腹腔阿糖胞苷200 mg/kg×2 d+50 mg/kg×3 d組及阿糖胞苷100 mg/kg×2 d+50 mg/kg×3 d組在給藥后第7天白細(xì)胞數(shù)量均顯著降低，且阿糖胞苷200 mg/kg組白細(xì)胞降的更低，導(dǎo)致小鼠死亡率也較高。見(jiàn)表1。

表1 給藥后各組外周血白細(xì)胞數(shù)的變化過(guò)程（）

表1 給藥后各組外周血白細(xì)胞數(shù)的變化過(guò)程（）

注:與陰性對(duì)照組比較，△△P<0.01

WBC（×109/L）

2.2 阿糖胞苷對(duì)外周血血小板數(shù)（PLT）的影響

腹腔注射阿糖胞苷200 mg/kg×2 d+50 mg/kg×3 d組及阿糖胞苷100mg/kg×2 d+50mg/kg×3 d組均能明顯的降低血小板，且在實(shí)驗(yàn)第7、10天血小板能夠明顯的降低。見(jiàn)表2。

2.3 阿糖胞苷對(duì)外周血紅細(xì)胞數(shù)（RBC）的影響

腹腔注射阿糖胞苷200 mg/kg×2 d+50 mg/kg×3 d組及阿糖胞苷 100mg/kg×2 d+50mg/kg×3 d 組造模后，3、5、7、10 d 外周紅細(xì)胞的數(shù)量均沒(méi)有發(fā)生很大的變化（P＞0.05）。見(jiàn)表3。

2.4 阿糖胞苷對(duì)外周血血紅蛋白含量（HGB）的影響

注射阿糖胞苷200 mg/kg及100 mg/kg造模后，外周血紅蛋白含量沒(méi)有發(fā)生很大的變化，P＞0.05，見(jiàn)表4。

表2 給藥后各組外周血血小板數(shù)的變化過(guò)程（）

表2 給藥后各組外周血血小板數(shù)的變化過(guò)程（）

注：與陰性對(duì)照組比較，△△P<0.01

組別 劑量 例數(shù)PLT（×109/L）3 d 5 d 7 d 10 d陰性對(duì)照組Ara-C 0.2 ml/10g 200 mg/kg 100 mg/kg 11610456.6±63.1390.8±100.5370.0±57.4590.6±134.9386.3±32.9△△533.0±83.9626.6±129.9274.9±141.7△△380.2±112.4△△790.3±194.0483.1±112.1△△497.2 ± 110.1△△

表3 給藥后外周血紅細(xì)胞數(shù)的影響（）

表3 給藥后外周血紅細(xì)胞數(shù)的影響（）

陰性對(duì)照組Ara-C組別 劑量 例數(shù)0.2 ml/10 g 200 mg/kg 100 mg/kg RBC（×1012/L）3 d 5 d 7 d 10 d 116108.8±1.08.6±0.98.4±1.29.0±1.39.1±1.28.3±1.18.0±1.27.9±2.08.3±0.56.4±0.86.0±0.76.5±1.1

表4 給藥后外周血血紅蛋白含量的影響（）

表4 給藥后外周血血紅蛋白含量的影響（）

陰性對(duì)照組Ara-C組別 劑量 例數(shù)0.2 ml/10 g 200 mg/kg 100 mg/kg HGB（g/L）3 d 5 d 7 d 10 d 11610160.3±13.1153.5±10.1177.7±24.6126.0±15.2114.3±6.2134.8±42.7157.6±32.0151.1±27.1150.6±17.6132.8±23.4128.9±21.4128.5±19.8

2.5 腫節(jié)風(fēng)總黃酮對(duì)阿糖胞苷造成荷瘤小鼠外周血象的影響

阿糖胞苷100 mg/kg×2 d+50 mg/kg×3 d能夠明顯造成PLT、WBC的降低。腫節(jié)風(fēng)總黃酮在第7天對(duì)白細(xì)胞有顯著的影響，在第10天對(duì)血小板有顯著的影響。見(jiàn)表5、6。

表5 腫節(jié)風(fēng)總黃酮對(duì)阿糖胞苷致荷瘤小鼠外周血象的影響（第7天）（，n=10）

表5 腫節(jié)風(fēng)總黃酮對(duì)阿糖胞苷致荷瘤小鼠外周血象的影響（第7天）（，n=10）

注：與陰性對(duì)照組比較，△△P<0.01；與 Ara-C 組相比，*P<0.05，**P<0.01

陰性對(duì)照組Ara-C Ara-C+ZJF組別 劑量（mg/kg）0.2 ml/10 g 100150200250 PLT（×109/L）626.6±129.9274.9±141.7△△251.0±88.1308.3±60.9257.6±51.1 WBC（×109/L）5.9±2.02.1±0.5△△4.5±0.45.6±1.2**5.2±0.9*RBC（×1012/L）8.0±1.27.9±2.09.0±1.89.1±1.28.4±1.1

3 討論

阿糖胞苷是引起骨髓再生低下或障礙且伴全血細(xì)胞減少的藥物，因此實(shí)驗(yàn)研究利用其制作血小板減少模型。以往的研究[7-9]限于觀察腫節(jié)風(fēng)和阿糖胞苷對(duì)正常健康小鼠血小板的影響，但是臨床上阿糖胞苷僅限于腫瘤患者，因此本文以荷瘤小鼠為研究對(duì)象，觀察其對(duì)荷瘤小鼠血小板的影響。實(shí)驗(yàn)證明，荷瘤小鼠腹腔注射200 mg/kg和100 mg/kg均可造成血小板減少模型，但是由于荷瘤鼠免疫力差，200 mg/kg會(huì)導(dǎo)致老鼠死亡率高，100 mg/kg在實(shí)驗(yàn)第7～10天內(nèi)可以造成血小板減少模型，老鼠死亡率低，因此，我們認(rèn)為100 mg/kg的阿糖胞苷制作血小板減少模型更適合。腫節(jié)風(fēng)總黃酮在實(shí)驗(yàn)第7天對(duì)該阿糖胞苷造成的血小板減少模型有升高白細(xì)胞的作用，在第10天有升高血小板的作用。因此，對(duì)臨床用藥也有提示作用。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道其作用機(jī)制可能是腫節(jié)風(fēng)減輕化療藥物對(duì)骨髓系統(tǒng)的抑制，加速骨髓的巨核系造血功能的恢復(fù)，從而防止化療后血小板減少的發(fā)生。

表6 腫節(jié)風(fēng)總黃酮對(duì)阿糖胞苷致荷瘤小鼠外周血象的影響（第10天）（，n=10）

表6 腫節(jié)風(fēng)總黃酮對(duì)阿糖胞苷致荷瘤小鼠外周血象的影響（第10天）（，n=10）

注： 與陰性對(duì)照組比較，△P<0.05，△△P<0.01； 與 Ara-C組相比，*P<0.05，**P<0.01

陰性對(duì)照組Ara-C Ara-C+ZJF組別 劑量（mg/kg）0.2 ml/10 g 100150200250 PLT（×109/L）790.3±194.0440.0±189.9△△516.1±118.8517.4±159.3588.9±161.1**WBC（×109/L）6.1±2.65.7±1.9△4.1±2.26.1±2.27.8±2.4*RBC（×1012/L）6.4±1.36.0±0.95.5±1.05.8±0.96.6±1.4

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