李素婷 王寶源 楊鶴梅 齊潔敏 王 冉 (承德醫(yī)學(xué)院，河北 承德 067000)

酒精性肝病(ALD)是由于長期過量飲酒導(dǎo)致的中毒性肝損害。據(jù)統(tǒng)計，約2/3的酗酒者可發(fā)展成酒精性肝病，已逐漸發(fā)展為僅次于病毒性肝炎的第二大肝病，是當(dāng)今世界亟待解決的公共衛(wèi)生問題〔1〕。開發(fā)并篩選對ALD有確切防治作用的中藥新藥并應(yīng)用于臨床，是當(dāng)前面臨的重要課題。柴胡為傘形科植物柴胡的根部，具有解表退熱、疏肝解郁、升舉陽氣的功效。柴胡的主要有效成分為柴胡皂苷(SS)，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、降血脂等多方面藥理作用〔2，3〕。本實驗觀察柴胡總皂苷對實驗性ALD的防護作用和可能的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SD大鼠，雄性，清潔級，體重(200±21)g，北京實驗動物管理中心提供。

1.1.2 藥品與試劑 柴胡總皂苷(純度為30∶1):昆明長春花科技有限公司提供，臨用前以蒸餾水配置;56度紅星二鍋頭白酒:北京紅星釀酒廠生產(chǎn);谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)檢測試劑盒:北京中生生物工程公司。轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)、平滑肌肌動蛋白(α-SMA)單抗:購于武漢博士德工程有限公司。

1.1.3 主要儀器 半自動生化分析儀(MD-100):美國Bayer公司生產(chǎn)，721W微機型分光光度計:上海光學(xué)儀器五廠，Olympus光學(xué)顯微鏡和攝像顯微鏡:德國Leica公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及模型的建立〔4〕取SD大鼠45只，隨機分為3組。①酒精組(20只)，56度紅星二鍋頭白酒用蒸餾水配制成酒精40%的白酒，按10 ml/kg每日分兩次灌胃造模4 w，第5周酒精濃度升至50%，按10 ml/kg每日分2次繼續(xù)灌胃4 w，并輔以高脂飼料(由顆粒料、膽固醇和豬油按79∶1∶20的比例微波爐加熱制成)。②柴胡皂苷組(15只)，除每天灌胃白酒和高脂飼料外(方法同酒精組)，每天上午11點灌胃柴胡總皂苷200 mg/kg;③正常組(10只)，普通飼料通常方法喂養(yǎng)，自由進食、飲水，每天下午用等體積蒸餾水灌胃。各組于造模起第8周末斷頭處死大鼠。取血分離血清，取大鼠肝臟并稱重，在肝右葉同一部位切去肝組織，生理鹽水沖洗后，置10%甲醛溶液固定，24 h內(nèi)制成蠟塊。

1.2.2 指標(biāo)測定

1.2.2.1 肝功能指標(biāo)檢測 應(yīng)用半自動生化分析儀按賴氏法測定血清ALT、AST活性。

1.2.2.2 肝臟切片形態(tài)學(xué)觀察 取石蠟包塊進行常規(guī)切片，每張切片厚度為4 μm，作HE染色和V-G膠原纖維特殊染色，肉眼觀察和光鏡下觀察肝組織病理改變和纖維增生和分布情況。并參照文獻〔5〕制定的肝纖維化評定標(biāo)準(zhǔn)，在光鏡下觀察纖維化情況并進行評分。

1.2.2.3 免疫組化法檢測肝組織TGF-β1和α-SMA的表達

取各組組織切片，磷酸鹽緩沖液浸泡，梯度酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟，采用SABC法檢測TGF-β1、α-SMA在大鼠肝組織中的表達，結(jié)果判定參考文獻〔6〕。

2 結(jié)果

2.1 柴胡皂苷對ALD大鼠血清ALT、AST、活性的影響 和正常組比較，酒精組大鼠血清中ALT、AST活性顯著升高(P＜0.01)，而與酒精組相比，柴胡皂苷可明顯降低大鼠血清中ALT、AST活性(P＜0.01)。表明柴胡皂苷能夠保護大鼠肝細胞、穩(wěn)定肝細胞膜的結(jié)構(gòu)，對酒精性肝損傷具有保護作用。見表1。

表1 柴胡皂苷對ALD大鼠血清ALT、AST活性的影響(±s)

表1 柴胡皂苷對ALD大鼠血清ALT、AST活性的影響(±s)

與正常組比較:1)P＜0.01，與模型組比較:2)P＜0.01

組別 n ALT(U/L) AST(U/L)正常組10 21.25±6.91 36.34±2.19酒精組 10 84.20±4.121) 64.32±3.411)柴胡皂苷組 10 45.37±4.542) 39.24±4.102)

2.2 肝組織病理學(xué)觀察 肉眼觀察:正常大鼠肝臟外觀紅潤，表面光滑，質(zhì)地較軟;模型組大鼠外觀呈黃褐色，表面粗糙，有許多細小結(jié)節(jié)，質(zhì)地較脆;SS保護組肝臟表面稍有粗糙，質(zhì)地中等，形態(tài)接近正常。HE染色:正常組肝組織結(jié)構(gòu)正常，肝細胞索排列整齊，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，在肝細胞竇及匯管區(qū)有少量成纖維細胞，無肝細胞脂肪變性壞死;模型組大鼠肝組織病理損傷嚴(yán)重，肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝細胞呈氣球樣變及脂肪變性，肝細胞腫脹，胞質(zhì)疏松，可見較大脂滴;匯管區(qū)有炎癥細胞浸潤，纖維組織增生明顯，膠原纖維沿匯管區(qū)及中央靜脈周圍向肝小葉內(nèi)延伸，肝小葉失去正常的結(jié)構(gòu)特點。柴胡皂苷保護組上述癥狀明顯減輕，肝細胞有輕度空泡樣變性，纖維組織增生明顯減少。V-G染色:正常組結(jié)果同HE染色，無纖維化模型組匯管區(qū)可見大量膠原纖維，伸入肝小葉形成纖維間隔，肝竇內(nèi)有斷續(xù)狀膠原纖維沉積。柴胡皂苷保護組膠原纖維增生有不同程度的改善，纖維隔明顯變薄。肝纖維化積分:與模型組相比(18.48±2.42)分，柴胡皂苷保護組肝纖維化積分有明顯改善〔(13.78±1.82)分，P ＜0.01〕。

2.3 肝組織TGF-β1、α-SMA的表達及量化結(jié)果 肝組織切片免疫組化染色顯示:大鼠肝組織TGF-β1、α-SMA的表達以肝細胞胞漿為主，著色為黃色或棕黃色。正常組肝組織中α-SMA主要表達于匯管區(qū)動、靜脈壁，而模型組α-SMA在匯管區(qū)、纖維間隔和肝血竇處均呈陽性表達;柴胡皂苷保護組α-SMA表達較模型組有明顯減弱，僅在匯管區(qū)和纖維間隔內(nèi)有少量陽性細胞。正常肝組織中微弱表達TGF-β1蛋白，顯色很淡，模型組TGF-β1陽性信號明顯增強，陽性染色分布于變性的肝細胞、纖維化區(qū)、匯管區(qū)和血管壁，柴胡皂苷保護組TGF-β1表達明顯降低，結(jié)果統(tǒng)計學(xué)分析有顯著差異(P＜0.05)。見表2。

表2 柴胡皂苷對大鼠肝組織TGF-β1及α-SMA表達量化結(jié)果的影響(±s)

表2 柴胡皂苷對大鼠肝組織TGF-β1及α-SMA表達量化結(jié)果的影響(±s)

與模型組比較:1)P＜0.05

組別 n TGF-β1 α-SMA正常組組10 0 0模型組 12 6.88±1.42 6.26±2.14柴胡皂昔組 12 4.62±1.821) 3.78±1.621)

3 討論

肝纖維化的形成是肝細胞的慢性損傷、炎癥和不斷的組織重建，造成大量細胞外基質(zhì)(ECM)在肝臟廣泛沉積的病理過程。雖然多種細胞均能合成ECM，但肝星狀細胞(HSC)是肝纖維化中ECM的主要來源和肝纖維化過程起主要作用的細胞。各種致病因素造成肝損傷時，肝枯否細胞、竇內(nèi)皮細胞以及壞死的肝細胞等分泌多種細胞因子如TGF-β1、血小板衍生生長因子(PDGF)、表皮生長因子(EGF)等，隨同血小板、肝竇內(nèi)皮細胞等分泌多種細胞因子，共同作用于肝HSC，其結(jié)果是HSC發(fā)生基因表達和表型改變，表現(xiàn)為轉(zhuǎn)錄活化、信號分子活化及誘導(dǎo)早期結(jié)構(gòu)基因表達，使其細胞膜上表達多種細胞因子(如PDGF、TGF-β1)受體，對細胞因子產(chǎn)生應(yīng)答，增殖并轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞，表達α-SMA，具有收縮性、炎癥性和高增殖性，并合成大量的ECM在肝臟沉積〔7〕。因此，檢測α-SMA在肝臟的過度表達是判斷HSC活化的標(biāo)志。目前研究表明，轉(zhuǎn)化生長因子β1是促肝纖維化最強的細胞因子，活化的HSC是TGF-β1的主要來源〔8〕。肝損傷時，HSC、枯否細胞及其他細胞通過自分泌或旁分泌方式產(chǎn)生大量TGF-β1，TGF-β1通過自身調(diào)節(jié)機制，刺激上述細胞產(chǎn)生更多的TGF-β1，形成級聯(lián)放大效應(yīng)，導(dǎo)致TGFβ1的大量生成和激活。激活的TGF-β1與細胞膜上的相應(yīng)受體結(jié)合，使受體活化并作用于特異的受體蛋白向細胞內(nèi)傳遞信號，調(diào)節(jié)靶基因表達。主要表現(xiàn)為:刺激肝HSC活化和向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化;誘導(dǎo)基質(zhì)基因的表達;抑制細胞外基質(zhì)的降解〔9〕。因此，抑制肝組織TGF-β1的表達和HSC的活化，是對酒精性肝損傷保護作用的重要環(huán)節(jié)。本研究結(jié)果顯示SS對酒精性肝病有明顯的預(yù)防作用，其機制可能是:保護肝細胞的結(jié)構(gòu)和功能，抑制TGF-β1信號傳導(dǎo)對肝星形細胞的活化，減少細胞外基質(zhì)的大量分泌和異常沉積。

1 莊 輝.酒精性肝病的流行病學(xué)〔J〕.中華肝臟病雜志，2003;1(11):698.

2 何美姍，孫小玉.正柴胡飲顆粒的解熱及抗過敏作用〔J〕.中成藥，2002;24(8):284-5.

3 于慶海.柴胡皂苷的抗炎作用初探〔J〕.沈陽藥學(xué)院學(xué)報，1986;3(1):14-6.

4 李舒丹，厲有名，虞朝輝.大鼠慢性酒精性肝損傷模型的建立〔J〕.浙江醫(yī)學(xué)，2002;24(9):524-6.

5 王泰齡，劉 霞，周元平，等.慢性肝炎炎癥活動度及肝纖維化程度記分方案〔J〕.中華肝臟雜志，1998;6(4):195-6.

6 歐陽燦輝，朱 萱，張琨和，等.熊果酸對肝纖維化大鼠肝組織TGF-β2和α-SMA表達的影響〔J〕.世界華人消化雜志，2009;17(22):2237-43.

7 張春燕.肝星形細胞的活化對肝纖維化形成的影響〔J〕.當(dāng)代醫(yī)學(xué)，2007;131(12):170-2.

8 Gressner AM，Weiskirchen R.Modem pathogenetic concepts of liver fibrosis suggest stellate cells and TGF beta as major players and therapeutic targets〔J〕.Cell Mol Med，2006;10(1):76-99.

9 韋燕飛，彭 岳，謝海源，等.基于肝星狀細胞分子機制的抗肝纖維化研究進展〔J〕.世界華人消化雜志，2009;17(17):1745-8.