羅 夏 包志強 孫樹青 楊麗敏

螺旋藻（Spirulina）富含優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)、維生素、多種礦物質(zhì)、微量元素和γ－亞麻酸等不飽和脂肪酸及β－胡蘿卜素等，所含人體必需氨基酸與聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）及世界衛(wèi)生組織（WHO）所推薦的人體需要量（RDA值）極其相近［1］，所含多種生物活性物質(zhì)，具有高消化吸收率，因而被FAO和世界食品協(xié)會譽為“人類最理想和21世紀最佳食品”。研究表明，螺旋藻安全、無毒，并且具有抗輻射、抗貧血、抗氧化、抗疲勞、抗腫瘤、抗衰老等作用［2］。但其對人體免疫細胞（淋巴細胞等）的生物學(xué)效應(yīng)還未見報道。本實驗研究螺旋藻水提物對人外周血淋巴細胞體外增殖能力的影響。

1 資料與方法

1.1 材料

1.1.1 血液：由呼和浩特市中心血站提供健康人新鮮靜脈血，即刻使用。

1.1.2 藥品及試劑：實驗用螺旋藻源自鄂爾多斯高原堿湖，由內(nèi)蒙古加利螺旋藻業(yè)有限責任公司提供，鏡檢為生長良好、純度較高的野生鈍頂螺旋藻，藻粉為干凈藻泥經(jīng)120℃瞬時噴霧干燥后產(chǎn)品。刀豆蛋白A IV型（Con A IV型）為白色易溶凍干粉末，購于美國Sig ma公司。注射用植物血凝素（PHA），每支含凍干粉劑10 mg，購于美國Sig ma公司。

RPMI 1640培養(yǎng)基由美國Gibco公司生產(chǎn)；無鈣鎂PBS（國產(chǎn)試劑配制）、胎牛血清（FBS）由杭州四季青生物工程材料有限公司生產(chǎn)；胰蛋白酶由美國Gibco公司生產(chǎn)；淋巴細胞分離液購自中科院生物工程研究所；二甲基亞砜（DMSO）、四甲基偶氮唑鹽（MTT）購于美國Sig ma公司。其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 儀器：CO2培養(yǎng)箱（美國 For maSeientifie公司，31645／N32221－1935型）；酶標儀（美國 Bio－Rad公司，i Mar k型）；超純水儀（德國 Millipore公司，M293986型 ）。

1.2 方法

1.2.1 螺旋藻水提物制備及Con A、PHA溶液的配制：稱取螺旋藻粉，按1∶20加入I級純化水溶解，充分緩慢攪拌均勻，將溶解液－20℃冷凍，4℃融解，反復(fù)凍融3～4次并進行超聲波破碎，所得細胞懸液用低速離心機離心后取上清液。上清液用透析膜透析，透析后得到膜內(nèi)和膜外液體，分別冷凍過夜，再放入冷凍干燥機中干燥，最后收集粉末，即為螺旋藻水提膜內(nèi)物和膜外物。精確稱取Con A及PHA粉劑，用RPMI－1640液分別配制成20μg／ml和100μg／ml溶液，0.22μm濾膜過濾除菌，4℃保存。

1.2.2 淋巴細胞分組及體外培養(yǎng)方法：取上述靜脈血50 ml用淋巴細胞分離液離心（2 000r／min，15 min），輕取白霧層，用 RPMI 1640液離心（800 r／min，6 min）2次，重懸，調(diào)整細胞密度為5×106個／ml，同時行臺盼藍染色，觀察細胞存活率大于95%，將細胞懸液按每孔0.1 ml接種于96孔培養(yǎng)板中，每組6孔。分為正常對照組、Con A和PHA陽性對照組、螺旋藻水提物膜內(nèi)和膜外組，兩陽性對照組和兩螺旋藻水提物組均按20μg／ml和100μg／ml不同濃度的藥液加入各孔，每個濃度6孔，終體積均以RPMI 1640液補至每孔200μl。將培養(yǎng)板置入37℃，5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)72h。

1.2.3 MTT法檢測細胞增殖能力：培養(yǎng)結(jié)束前4h，每孔加入 MTT（5 g／L）20μl，繼續(xù)孵育4h后，經(jīng)2 000r／min，離心8 min后，輕輕吸棄上清液，每孔加入DMSO 150μl，輕輕振蕩5 min，室溫靜置10 min，490n m波長處檢測其吸光度（OD）值，并按下述公式分別計算各組淋巴細胞增殖率。

增殖率 ＝ （藥物組OD－對照組OD）／對照組OD×100%

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，首先對各組數(shù)據(jù)進行正態(tài)檢驗（normality Plots with Tests），方差齊時采用單因素方差分析（One－way ANOVA），方差不齊時采用非參數(shù)檢驗（Nonparametric Tests）。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

在一定細胞密度范圍內(nèi)，OD值大小可以反映活細胞數(shù)量，即與增殖率呈正比。本實驗結(jié)果表明，各種藥物均有刺激淋巴細胞增殖的作用，其增殖率高于正常對照組（P＜0.01）。PHA和Con A作為傳統(tǒng)的淋巴細胞激活劑均可不同程度提高淋巴細胞增殖率，并且與濃度有關(guān)，濃度高者增殖率也高；PHA促淋巴細胞增值作用強于Con A（P＜0.05），與文獻報道［3］一致。螺旋藻水提物對淋巴細胞亦有提高增殖率作用，高濃度水提膜內(nèi)物強于膜外物（P＜0.01）；100μg／ml水提膜內(nèi)物促淋巴細胞的增殖作用比PHA更強（P＜0.05），而水提膜外物（20μg／ml）與相同濃度PHA的作用等效（P＞0.05）。由此可見，螺旋藻高劑量水提膜內(nèi)物和低劑量水提膜外物提高淋巴細胞的增殖率作用強于Con A，而與PHA作用等效。見表1和圖1。

表1 不同藥物對正常淋巴細胞增殖作用的影響（±s，n均＝6）

表1 不同藥物對正常淋巴細胞增殖作用的影響（±s，n均＝6）

注：與正常對照組比較，1）P＜0.01；與Con A組比較，2）P＜0.05；與螺旋藻膜外組比較，3）P＜0.01；與PHA（100μg／ml）組比較，4）P＜0.05

組別 藥物濃度（μg／ml） OD 增殖率（%）正常對照組 — 0.375±0.024—PHA 組 20 0.635±0.028 69.331）2）100 0.666±0.021 77.60 1）2）Con A 組 20 0.471±0.030 25.60 1）100 0.531±0.017 41.601）螺旋藻膜內(nèi)組 20 0.586±0.022 56.27 1）100 0.695±0.012 85.33 1）3）4）螺旋藻膜外組 20 0.626±0.019 66.93 1）100 0.546±0.035 45.601）

3 討 論

圖1 不同藥物作用72h的淋巴細胞增殖率

螺旋藻是藍藻類的一個屬，廣泛分布于海洋或湖沼，尤其是鹽堿湖等［4］；螺旋藻是近年來國內(nèi)外研究與開發(fā)的熱點，國內(nèi)已先后研制了以螺旋藻為原料的抗輻射、抗氧化、抗腫瘤和抗衰老等藥品。螺旋藻具有特殊的生物活性，能有效消除體內(nèi)自由基對組織細胞的損傷，提高免疫功能，預(yù)防疾病，促進人體健康［5］。免疫細胞包括巨噬細胞、淋巴細胞等，其在機體免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，免疫細胞減少或功能缺失會使機體產(chǎn)生病變。淋巴細胞在有絲分裂原（如Con A、PHA等）刺激下，可進行新的DNA合成及細胞分化、增殖［6～8］，而增加淋巴細胞數(shù)量。與放射性同位素標記法和形態(tài)學(xué)方法比較起來，MTT比色法檢測淋巴細胞增殖更加簡便、準確、安全。

本實驗結(jié)果顯示，螺旋藻水提物能提高人淋巴細胞增殖率。與傳統(tǒng)的淋巴細胞增殖藥物相比，其作用有明顯提高，其中螺旋藻水提膜內(nèi)物高劑量組的增殖率最高。這種作用可能與其分子量大小及分子激活情況有關(guān)。螺旋藻水提取物經(jīng)過透析膜后，膜外物中為小分子量物質(zhì)，容易作用于細胞，因此低劑量即可達到較高的增殖效果（圖1），而膜內(nèi)物的作用，尤其高劑量組的增殖效果甚至超過了PHA，則與其分子激活、開啟或關(guān)閉不同的信號通路有關(guān)，反映出不同種類細胞在相同信號刺激下，以及同種類型細胞在不同信號刺激下對刺激的應(yīng)答效果或程度可存在差異［9～12］。同時提示只有重視信號傳導(dǎo)通路的深入研究，才能探索出細胞生長抑制規(guī)律。至于螺旋藻哪種成分在人免疫系統(tǒng)中起主導(dǎo)作用有待進一步研究。

1 吳開國.螺旋藻對機體免疫調(diào)節(jié)的研究概況.廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2004，21（1）：147～148.

2 涂 芳，楊 芳，鄭文杰，等.螺旋藻多糖的研究進展.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2007，17（1）：115～118.

3 劉 英，程 翔，廖玉華.地爾硫卓對刀豆凝集素誘導(dǎo)單個核細胞細胞因子表達的影響.中國藥理學(xué)通報，2010，26（3）：376～378.

4 董 艷，劉曉婷，王淑娥，等.螺旋藻的降血糖作用.中國海洋藥物雜志，2008，27（3）：46～47.

5 張志娟，喬明霞，郝言芝，等.復(fù)合螺旋藻多糖對人肝癌7402細胞的抑制作用.陜西醫(yī)學(xué)雜志，2009，38（3）：279～281.

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7 張 濤，趙 蕊，柳朝陽，等.川芎嗪對T淋巴細胞活化增殖的影響.中國老年學(xué)雜志，2009，29（13）：1 658～1 659.

8 陳光星，李曉娟，劉清平，等.青藤堿對T淋巴細胞活化增殖的影響.廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2008，25（5）：425～428.

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10 Lee JB，Sriso mpor n P，Hayashi K，et al.Effects of str uctural modification of calciumspir ulan，a sulfacted poly－saccharide from－Spirulina platensis，on antiviral activity .Chem Phar m Bull，2007，49（1）：108～110.

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12 Majdoub H，Ben Mansour M，Chaubet F，et al.Anticoagulant activity of a sulfated polysaccharide from the green alga arthrospira platensis.Biochi m Biophys Acta，2009，1 790（10）：1 377～1 381.