楊 瑾，陽 輝，陳龍全，沈正龍

湖北民族學院醫(yī)學院(湖北恩施，445000)

天山堇菜Viola tianshanica Maxim.為堇菜科Violaceae堇菜屬植物，多年生草本，以全草入藥［1］。Binafuxi為天山堇菜的維吾爾醫(yī)習用名稱，有調(diào)理、軟化、發(fā)汗的作用，主要用于各種發(fā)燒、受寒、感冒、咽炎、疔瘡腫癰等癥，在新疆和田地區(qū)民間廣泛應用。《維吾爾藥志》記載，天山堇菜“微苦，辛，涼”，“清熱解毒，主要用于感冒發(fā)熱、疔瘡中毒、淋巴腫大”［2］。天山堇菜的化學成分以及藥理活性都少有文獻報道，作者立足對天山堇菜乙醇提取物的體外抗腫瘤實驗篩選，跟蹤發(fā)現(xiàn)活性成分主要集中在低極性部分［3，4］。天山堇菜揮發(fā)油成分的GC－MS分析與抗菌活性之前有過報道，其提取工藝、抗炎作用目前還未見報道。作者對天山堇菜揮發(fā)油的提取時間進行了考察，并設計急性炎癥模型對其抗炎作用進行初步探討。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 FZ－102微型植物樣品粉碎機(上海安銳自動化儀表有限公司);SK3200HP超聲儀(上海科導超聲儀器有限公司);Sartorius電子分析天平;標準檢驗篩(20目，浙江省上虞市五四紗篩廠);揮發(fā)油提取器(北京玻璃儀器廠);DZTW電子調(diào)溫電熱套(北京市永光明醫(yī)療儀器廠);耳沖打耳器(8 mm)。所有試劑均為分析純。

1.2 實驗動物 SPF級BALB/c雄性小白鼠，體重20.0±2.0 g，由武漢大學動物實驗中心提供。小白鼠喂養(yǎng)一周，觀察有無異常反應或其它情況，健康正常的小鼠用于實驗。

1.3 實驗藥材 天山堇菜(Viola tianshanica Maxim.)，新疆醫(yī)科大學藥學院熱娜·卡斯木教授鑒定、提供。

1.4 實驗方法

1.4.1 蒸餾時間對揮發(fā)油提取率的影響 按中國藥典［5］2010版一部附錄X D的方法(中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會，2010)提取天山堇菜揮發(fā)油。稱取天山堇菜粉末50 g，粉碎，過20目篩，預實驗結(jié)果表明［6，7］，天山堇菜粉末與蒸餾水比例為 1∶7時，藥材粉末可被完全浸沒，考慮到藥材粉末浸泡膨脹以及提取中水蒸氣的損耗，因此將天山堇菜粉末與蒸餾水的比例調(diào)整為1∶10。

將天山堇粉末置于1000 ml圓底燒瓶中，加入500 ml水和少許玻璃珠，搖勻，電熱套緩慢加熱，分別考察提取時間為 1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、7 h 等時點揮發(fā)油的得率。用乙醚萃取3次油狀液體，減壓回收乙醚，無水硫酸鈉干燥后過濾，得淡黃色油液。

天山堇菜揮發(fā)油在干燥至恒重后，稱重計算出油率。其出油率按下式計算:

其中，Y:出油率;W1:提取天山堇菜揮發(fā)油質(zhì)量(g);W2:天山堇菜粉末質(zhì)量(g)。

1.4.2 抗炎作用實驗 根據(jù)炎癥發(fā)展過程中不同時期的病理特點，實驗炎癥模型主要分為三類:以血管通透性增強，白細胞游走和炎癥介質(zhì)釋放為主要改變的各種早期炎癥模型;以免疫活性細胞激活為主要特征的中期炎癥模型;以血管及組織增生為主要特征的各種晚期炎癥模型。天山堇菜揮發(fā)油抗炎作用的考察選用了急性炎癥模型，即二甲苯致小鼠耳腫脹［8，9］。該實驗以局部血管擴張和毛細血管通透性增加為特征，反應藥物對炎癥早期血管通透性增加的影響程度。

取預實驗合格的小鼠40只，體重18～22 g，隨機分成4組，每組10只，空白對照組(生理鹽水)、低劑量組(0.1 ml/kg)、高劑量組(0.2 ml/kg)、陽性對照組(阿司匹林10 mg)?？瞻讓φ战M、低劑量組和高劑量組的小鼠進行灌胃(ig)，每日1次，連續(xù)3 d;陽性對照組于實驗當天腹腔注射(ip)。末次給藥30 min后，于小鼠右耳兩面均勻涂抹20 μl二甲苯致炎，左耳作為對照，致炎后30 min處死動物，剪下兩耳用8mm打孔器分別在同一位置打下圓耳片，電子天平精密稱重，以左右耳片重量之差為腫脹度，計算腫脹抑制百分率:

揮發(fā)油提取法有有機溶劑提取法、水蒸餾法、超臨界萃取法等。水蒸餾法節(jié)省溶劑，無污染、成本低，便于操作，故實驗采用此方法作為天山堇菜中揮發(fā)油的提取方法。實驗證明，其蒸餾時間確定為6 h，揮發(fā)油得率可達0.76%。

2 結(jié)果

2.1 天山堇菜揮發(fā)油提取的最佳時間 蒸餾初始時，天山堇菜揮發(fā)油快速與水蒸氣形成共沸，快速蒸發(fā)出來，持續(xù)到4 h。此后揮發(fā)速度有所減慢，90%左右的天山堇菜揮發(fā)油5 h以內(nèi)已經(jīng)提取出來，藥渣中揮發(fā)油類成分減少，油水比例相應減低，共沸點升高，揮發(fā)油餾出的量迅速減少。水蒸氣蒸餾6 h，95%左右的揮發(fā)油被提取出來，繼續(xù)蒸餾，揮發(fā)油的量增加逐漸呈負數(shù)。考慮到長時間加熱，可能會使已經(jīng)提取出來的揮發(fā)油再次揮發(fā)損耗，因此天山堇菜揮發(fā)油的蒸餾時間確定為6 h，天山堇菜揮發(fā)油得率為0.76%(以天山堇菜藥材干品重量計)。見圖1。

圖1 天山堇菜揮發(fā)油水蒸氣提取率測定

2.2 天山堇菜揮發(fā)油對小鼠耳腫脹度的抑制 從表1 可見，揮發(fā)油劑量為0.1ml/kg、0.2ml/kg 時，腫脹抑制率為24.62%、37.13%，與生理鹽水的空白對照組比較有顯著性差異，表明天山堇菜揮發(fā)油對炎癥具有一定的抵抗作用，呈現(xiàn)劑量相關(guān)性。

表1 天山堇菜揮發(fā)油對二甲苯所致小鼠耳腫脹度的影響(n=10)

3 討論

揮發(fā)油提取法有有機溶劑法、蒸餾法、萃取法等。蒸餾法節(jié)省溶劑，無污染，成本低，便于操作，故我們采用此方法提取天山堇菜中的揮發(fā)油。實驗結(jié)果證明，其最適蒸餾的時間為6 h，揮發(fā)油得率可達0.76%。炎癥是由炎癥細胞及其釋放的炎癥介質(zhì)參與引起的一系列病理生理過程。炎癥反應可引起毛細血管擴張，通透性增加，中性粒細胞趨化、游走至炎癥反應灶，釋放炎癥介質(zhì)，并產(chǎn)生O·－2等活性氧自由基。由于炎性滲出引起組織水腫，會導致炎癥局部形態(tài)膨脹、體積增大，還會使發(fā)炎器官的重量增加［10～13］。

給小鼠的耳廓涂抹二甲苯引起耳廓腫脹，采用重量法測定耳廓腫脹程度，結(jié)果灌服天山堇菜揮發(fā)油的小鼠耳片的增重值顯著小于空白組，可見天山堇菜揮發(fā)油對早期、急性炎癥具有確切的抑制作用。這也許是天山堇菜能治療發(fā)燒、受寒、感冒、咽炎、疔瘡腫癰的物質(zhì)基礎之一。中草藥的抗炎作用機制十分復雜，難以具體分類。一種中草藥的不同活性成分往往具有不同的作用機制;有時即使是同一成分，其作用機制也可因機體的免疫狀態(tài)的不同而不同。中草藥是天然產(chǎn)物，一種中草藥包含多種活性成分，并且存在一種中草藥中的多種活性成分均有抗炎作用的現(xiàn)象。對于這些活性成分是否在抗炎過程中起協(xié)同作用，相互之間的作用是如何進行的并不十分清楚，尚需進一步采用新技術(shù)、新方法進行深入研究。下一步我們將對天山堇菜揮發(fā)油的化學成分進一步分離和純化，為其抗炎作用的物質(zhì)基礎和作用機理提供科學依據(jù)。在以后的工作中我們將在其進行活性指導下，對天山堇菜揮發(fā)油的化學成分進一步分離和純化，為抗炎作用的物質(zhì)基礎和作用機理提供科學依據(jù)。而天山堇菜非揮發(fā)性化學成分及其藥理活性還有待進一步的研究。

［1］新疆維吾爾自治區(qū)衛(wèi)生廳.維吾爾藥材標準［M］.烏魯木齊:新疆科技衛(wèi)生出版社，1993:54.

［2］劉勇民.維吾爾藥志(上冊)［M］.烏魯木齊:新疆科技衛(wèi)生出版社，1993:35－37.

［3］Yang，Jin ，Xiao Yuling，Xianran He，et al.Potential Anticancer Activity of Viola tianshanica Extracts and Chemical Composition Analysis［C］.Wuhan，2009:116.

［4］Jin Yang，Xiao Yuling，Xianran He，et al.Aesculetin－induced apoptosis through ROS－mediated mitochondrial dysfunction pathway in human cervical cancer cells［J］.J Asian Nat.Prod.Res，2010，12(3):185－193.

［5］中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會.中華人民共和國藥典［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2005，Ⅰ:237.

［6］Yang J，Zhen Q，Xiao YL，et al.Chemical Chemical Composition and Antioxidant Activity of the Essential Oil of Endemic Viola Tianshania［J］.Nat Prod Res，2011，25(17):1635－1640.

［7］盧紅梅，郭方遒，伍賢進，等.血腥草注射液與其藥材揮發(fā)油相關(guān)組分的分析［J］.分析化學，2009，39(11):1706－1710.

［8］吳龍火，劉昭文，許瑞安.魚腥草注射液與其藥材揮發(fā)油相關(guān)組分的分析［J］.分析化學，2009，39(11):1706－1710.

［9］邵峰，李賽雷，劉榮體，等.附子不同炮制品鎮(zhèn)痛抗炎作用研究［J］.時珍國醫(yī)國藥，2011，22(10):2329－2330.

［10］Lee，M.Y.，Yuk，J.E.，Kwon，O.K，et al.Anti－inflammatory and anti－asthmatic effects of Viola mandshurica W.Becker(VM)ethanolic(EtOH)extract on airway inflammation in a mouse model of allergic asthma［J］.J.Ethnopharmacol.，2010，127(1):159－164.

［11］Geethangili，M.，F(xiàn)ang，S.H.，Lai，C.H.，et al.Inhibitory effect of Antrodia camphorata constituents on the Helicobacter pylori－associated gastric inflammation［J］.Food Chem，2010，119(1):149－153.

［12］Castello，L.，F(xiàn)roio，T.，Maina，M.，Cavallini，G.，Biasi，F(xiàn).，Leonarduzzi，G.，Donati，A.，Bergamini，E.，Poli，G.，Chiarpotto E.Alternate－day fasting protects the rat heart against age－induced inflammation and fibrosis by inhibiting oxidative damage and NF－κB activation［J］.Free Radical Biol.Med.，2010，48(1):47－54.

［13］Sabina，E.P.，Rasool，M.K.，Mathew，L.，EzilRani，P.，Indu，H.6－Shogaol inhibits monosodium urate crystal－induced inflammation－An in vivo and in vitro study［J］.Food Chem.Toxicol.，2010，48(1):229－235.