劉澤林，陳 燕

（1.南昌大學第四附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，南昌330003；2.武警江西總隊醫(yī)院內(nèi)科，南昌330001）

近年的研究發(fā)現(xiàn)骨髓干細胞具有誘發(fā)血管新生的潛能，并且能用于改善缺血性臟器的血流和功能［1］。基于這一特性，國內(nèi)外已廣泛開展了利用病人自體的骨髓干細胞來治療冠心病及其他缺血性心血管疾病的臨床試驗［2］。盡管很多臨床試驗報告了這一新治療技術(shù)是安全的，但有些患者的治療效果并不理想［3］。其原因可能與患者自體的骨髓干細胞的質(zhì)量及缺血性臟器的局部狀況有關(guān)。有研究資料顯示，糖尿病等可能導致骨髓干細胞受損，并影響其誘發(fā)血管新生的潛能［4－5］。本研究的目的旨在調(diào)查糖尿病對骨髓干細胞產(chǎn)生血管生長因子（VEGF）的能力以及骨髓干細胞向內(nèi)皮細胞分化能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1）實驗動物：雌性18周齡的糖尿病肥胖大鼠（實驗組）和非糖尿病健康大鼠（對照組）大鼠各20只（均由日本山口大學醫(yī)學部試驗動物中心提供）。

2）主要試劑：VEGF測定試劑、RPMI1640培養(yǎng)基等試劑均由日本山口大學醫(yī)學部試驗中心提供。

1.2 方法

1.2.1 骨髓干細胞的采集及培養(yǎng)

取出大腿骨并把骨髓細胞單離浮游于PBS溶液中。應用比重離心法從骨髓細胞中分離純化骨髓單核細胞。把新鮮分離采集的骨髓單核細胞浮游于RPMI 1640培養(yǎng)基（3×106cells·mL－1）中，并添加15%胎兒牛血清（Gibco）、100U·mL－1青霉素和100μg·mL－1鏈霉素。細胞培養(yǎng)于37℃含5%CO2濕化培養(yǎng)箱內(nèi)。

1.2.2 細胞生存的測定

在細胞培養(yǎng)第3、7天后取出培養(yǎng)細胞并用0.4% 臺盼藍溶液染色后測出生存的細胞數(shù)。按培養(yǎng)前的細胞總數(shù)計算出細胞的生存率。

1.2.3 VEGF濃度的測定

在培養(yǎng)第3、7天后，取出培養(yǎng)基上清液冷凍保存。應用酶聯(lián)免疫標記（ELISA）法分別測定培養(yǎng)基上清液中VEGF的濃度。

1.2.4 骨髓干細胞的內(nèi)皮細胞分化檢測

細胞培養(yǎng)于4井室培養(yǎng)玻片（鋪有0.2mg·mL－1纖維連接蛋白）上，并添加50ng·mL－1VEGF、5ng·mL－1堿性成纖維細胞生長因子和5ng·mL－1胰島素樣生長因子－1于培養(yǎng)基中。培養(yǎng)第7天后，用1%福爾馬林固定細胞并用FITC熒光標示的抗VE－cadherin抗體進行免疫染色來檢測內(nèi)皮細胞分化潛能。

1.2.5 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 細胞生存率

細胞培養(yǎng)第3天細胞生存率：實驗組與對照組分別為（30.1±2.4）%、（31.9±3.8）%，2組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；細胞培養(yǎng)第7天細胞生存率：實驗組與對照組分別為（18.5±3.1）%、（20.4±1.9）%，2組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.2 VEGF濃度

培養(yǎng)第3、7天后培養(yǎng)基上清液中VEGF的濃度：實 驗 組 分 別 為 （134.8±27.5）、（282.7±25.2）ng·mL－1，對照組分別為 （189.1±25.6）、（370.2±40.1）ng·mL－1，2組相比，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

2.3 骨髓干細胞的內(nèi)皮細胞分化

實驗組培養(yǎng)第7天后骨髓干細胞的內(nèi)皮細胞分化率為（14.7±4.5）%，顯著低于對照組的（32.8±5.6）%（P＜0.01）。

3 討論

本研究顯示糖尿病大鼠的骨髓細胞產(chǎn)生血管新生子VEGF的量要比非糖尿病健康大鼠明顯減少。在相同培養(yǎng)條件下，糖尿病大鼠的骨髓細胞定向分化成內(nèi)皮細胞的比率也比非糖尿病健康大鼠明顯降低，這些結(jié)果證明了糖尿病可以導致骨髓細胞的功能低下。其原因和分子機制還不明白，這有可能是由于糖尿病狀態(tài)下很多炎癥性因子升高而且氧化應急增強，抗氧化功能減退［6］，從而影響到骨髓干細胞的細胞周期調(diào)節(jié)因子和干細胞維持所需因子的改變，最終導致骨髓干細胞的凋亡，分化成熟，以及功能低下。

以前的研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病病人血液中的內(nèi)皮前驅(qū)細胞數(shù)量減少［7］。由于血液中的內(nèi)皮前驅(qū)細胞來源于骨髓干細胞，這可能是由于糖尿病引起骨髓干細胞的功能損害，從而導致骨髓中放出到血液中的內(nèi)皮前驅(qū)細胞數(shù)量減少。由于內(nèi)皮前驅(qū)細胞具有修復血管內(nèi)皮的作用，血液中的內(nèi)皮前驅(qū)細胞數(shù)量減少將會引起受到損害血管內(nèi)皮細胞得不到及時修復，因而產(chǎn)生血栓形成和血管閉塞，也可以說明為何在臨床上糖尿病病人并發(fā)缺血性疾病的比率要比健康人高。

盡管本文沒有使用缺血性動物模型對糖尿病和健康鼠的骨髓細胞誘發(fā)血管新生作用進行比較，但從本文的結(jié)果可以推測出糖尿病患者的自身骨髓細胞誘發(fā)血管新生作用可能降低，因而限制了使用糖尿病病人的自身骨髓干細胞來治療他們的缺血性疾病或其他疾病。由于目前還不明白糖尿病是如何影響骨髓細胞功能的分子機制，因此，下一步的工作應該是去揭開糖尿病導致骨髓細胞功能損害的分子機制之謎，然后找到使其功能得到恢復的方法。這將會大大改善糖尿病病人的自身骨髓干細胞用于誘發(fā)血管新生等治療的效果。同時，糖尿病病人的骨髓細胞功能的恢復也有可能使血液中的內(nèi)皮前驅(qū)細胞數(shù)量升高［8］，從而將降低缺血性疾病的并發(fā)率。

綜上所述，糖尿病不僅可以導致骨髓細胞產(chǎn)生血管新生因子的能力降低而且會導致骨髓干細胞定向分化成內(nèi)皮細胞的功能低下，這將需要醫(yī)學工作者對糖尿病病人在利用自身骨髓干細胞治療缺血性疾病之前，找到一種有效的方法使其骨髓干細胞的機能得到恢復和改善。

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