劉嘉俊 李汴生

（1華南理工大學輕工與食品學院，廣州 510641） （2廣東輕工職業(yè)技術學院食品與生物工程系，廣州 510300）

固定化木瓜蛋白酶的研究進展

劉嘉俊1，2*李汴生1

（1華南理工大學輕工與食品學院，廣州 510641） （2廣東輕工職業(yè)技術學院食品與生物工程系，廣州 510300）

木瓜蛋白酶具有水解蛋白質能力強的特點，但游離的木瓜蛋白酶穩(wěn)定性差，難以回收利用；固定化木瓜蛋白酶既保持了酶的催化性質，又克服了游離酶的不足，具有廣泛的發(fā)展前景。

木瓜蛋白酶；固定化；應用

1 木瓜蛋白酶及其固定化應用

木瓜蛋白酶別名為木瓜酶，純木瓜蛋白酶是有由212個氨基酸組成的單鏈蛋白質，相對分子質量為23 406。制品可含有木瓜蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶和溶菌酶等不同的酶，為乳白色至微黃色粉末，具有木瓜特有的氣味，稍具有吸濕性。水解蛋白質能力強，但幾乎不能分解蛋白胨。最適作用溫度65℃，最適作用pH為5.0，易溶于水、甘油，不溶于一般的有機溶劑，等電點為pH8.75。

雖然木瓜蛋白酶具有催化能力強，作用底物專一，反應條件溫和等優(yōu)點，但穩(wěn)定性差，在溫度、pH和無機離子等外界因素影響下，容易變性失活，而且木瓜蛋白酶一般都是在水溶液中與底物反應，這樣酶在反應系統(tǒng)中，與底物和產物混在一起，反應結束后，即使酶仍有較高活力，也難以回收利用。這種一次性使用酶的方式，不僅成本較高，而且難以連續(xù)化生產。因此，近年來一直在研究固定化木瓜蛋白酶技術，人們試圖用固定化的方法使木瓜蛋白酶固定在載體上，并在一定空間范圍內進行催化反應。固定化酶既保持了酶的催化活性，又克服了游離酶的不足，具有增加穩(wěn)定性、可反復或連續(xù)使用以及易于和反應產物分開等顯著優(yōu)點。

2 木瓜蛋白酶固定化的基本原理

酶的固定化方法有吸附法、包埋法、交聯(lián)法等，這些方法各有利弊。載體材料作為固定化酶的重要部分，其結構和性能對固定化酶的酶學性質有很大的影響，因此很多學者一直致力于對載體的研究，以求獲得適合于某種酶的價格低廉的載體，以及操作簡便和酶活力回收更高的固定化方法。

3 木瓜蛋白酶的固定化技術

3.1 吸附法

近年的研究中關于木瓜蛋白酶的固定化技術使用較多的是吸附法，吸附法主要有物理吸附法和離子交換吸附法兩種。物理吸附法是以比表面積較大的物質為載體（無機載體如活性氧化鋁、活性碳、皂土、硅藻土、高嶺土、多孔玻璃、硅膠，二氧化鈦等；有機載體如面筋、淀粉、纖維素、膠原、塞璐璐和火棉膠等），其特點是吸附作用選擇性不強，吸附不牢，還會引起吸附變性。離子交換吸附法是以DEAE-纖維素、CM-纖維素、DEAE-葡聚糖凝膠等為載體。2005年，高波等首次利用冷凍-真空吸附法在介孔材料SBA-15中固定了木瓜蛋白酶，與普通的浸漬方法相比，此法不僅可以制備高祖裝量的固定化酶，每克載體固定量可達450 mg，同時酶的活性仍然保持，并得到較好的固定化酶性質（如高穩(wěn)定性），在90℃保溫30 min仍可保留70%的活力。2005年，沈斌等提出酶的“柔性固定化”模型，并以Mannich反應得到單載量為0.4 mmol NH2/g～6.0 mmol NH2/g的胺化苯聚乙酰樹脂為載體，以雙醛淀粉為柔性鏈，對木瓜蛋白酶進行柔性固定化，酶活回收率可達40%～50%，相當于手臂固定化酶活力率的1.8～2.4倍，且柔性固定化酶穩(wěn)定性較好，該結果說明，酶的“柔性固定化”模型可以改善傳統(tǒng)共價結合固定化及手臂固定化酶活力回收率不高的缺陷。2007年，王安明等通過超聲條件下硅酸四乙酯與γ-氨丙基三乙氧基硅烷的同步水解，一步制備了帶氨基的二氧化硅微球，并在其表面沉積了銀納米粒子，以此負載銀的二氧化硅微球作為載體固定木瓜蛋白酶，研究了銀納米粒子負載量對木瓜酶固定化的影響，考察了固定化木瓜蛋白酶的性能，結果表明，當載體的銀負載量為0.68 g/100g時，固定木瓜蛋白酶活回收率達到最高，比使用未負載銀的載體提高了188%。該固定酶比游離酶具有更好的熱穩(wěn)定性，在重復使用20次后仍保持原有酶活的43%，4℃下儲存2個月后酶活基本沒有下降。

3.2 包埋法

包埋法是用物理或化學的方法把酶包埋在水不溶性凝膠或半透膜的微囊體中制成的。酶固定化后一般穩(wěn)定性增加，易從反應系統(tǒng)中分離，且易于控制，能反復多次使用，便于運輸和貯存，有利于自動化生產。2001年，李紅等研究了以殼聚糖微球為載體固定化木瓜蛋白酶的特性，包括其形態(tài)、外觀和酶學性質，結果表明：殼聚糖微球固定化木瓜蛋白酶是粒徑分布范圍較均勻的球形微粒，固定化酶的表觀米氏常數Kmapp（酪蛋白） 為0.055%，是溶液酶米氏常數Km的0.13倍，最適pH為8.0，pH穩(wěn)定性在7.0左右，熱穩(wěn)定性在15℃～35℃范圍內，操作半衰期為25 d，該結果為殼聚糖微球固定化木瓜蛋白酶酶反應器的試制和研究提供了重要的參考。2005年，劉琳琳等以磁性金屬鰲合瓊脂糖微球為載體，利用金屬鰲合配體（IDA-Cu2+）與蛋白質表面供電子氨基酸相互作用的原理，定向固定了木瓜蛋白酶。固定化最適條件為Cu2+1.5×10-2mol/g載體、固定化時間為4 h、固定化pH7.0、給酶量30 mg/g載體。固定化酶的最適反應溫度70℃、最適反應pH8.0，固定化酶的熱穩(wěn)定性明顯高于溶液酶，固定化酶活力回收為68.4%，具有較好的操作穩(wěn)定性，載體重復使用5次后固定化酶酶活力為首次固定化酶的79.71%。2008年，何平等以乙腈作為有機介質，在微水有機溶劑體系中以Boc-Trp-OH和Phe-NH2為底物，用海藻酸鈉、殼聚糖固定化木瓜蛋白酶催化合成Trp-Phe-NH2時，產率為27.8%，在這一合成反應中，對pH值、離子強度、溶液含量、反應溫度、酶用量和反應時間進行正交試驗，證明pH是本合成過程的最重要影響因素。反應體系以乙腈為有機介質，在微水有機溶劑體系中以Boc-Tyr-Pro-OMe和Trp－Phe-NH2為底物，用IPSAC催化合成Tyr-Pro－Trp-Phe-NH2，產率為35.2%。2008年，王紅玉等以糖和脂質體作為溶膠-凝膠法固定木瓜蛋白酶（Papain） 過程中的保護劑，研究了蔗糖、葡萄糖、海藻糖、木糖、麥芽糖及構成脂質體的正癸烷溶液中膽固醇含量、卵磷脂與膽固醇質量比等因素對固定化酶活性的影響。結果表明，80 μL20 mg/mLPapain溶液與15 mg木糖、500 μL正癸烷溶液（溶有體積分數1.5%的膽固醇，卵磷脂與膽固醇質量比為4.5∶1）充分混合后制備的固定化酶活性最高，在優(yōu)化條件下制備的固定化酶包封率為42.0%，活力回收率為61.2%；SEM分析表明，固定化酶形態(tài)呈球狀且大小均勻，內孔分布呈蜂窩狀；破膜劑對固定化酶活性發(fā)揮的影響研究表明，TritonX-100的效果最好。固定化酶包埋法是近十余年發(fā)展起來的酶應用技術，在工業(yè)生產、化學分析和醫(yī)藥等方面有著誘人的應用前景。

3.3 交聯(lián)法的應用

交聯(lián)法是依靠雙功能團試劑使酶分子之間發(fā)生交聯(lián)凝集成網狀結構，使之不溶于水從而形成固定化酶。常采用的雙功能團試劑有戊二醛、順丁烯二酸酐等。酶蛋白的游離氨基、酚基、咪唑基及巰基均可參與交聯(lián)反應。2004年，黃宜兵等以變性的卵清蛋白為載體，用戊二醛為交聯(lián)劑固定木瓜蛋白酶，通過正交試驗考察了固定化pH值、交聯(lián)劑戊二醛濃度、交聯(lián)時間和酶用量對固定化木瓜蛋白酶活力的影響，確定了最適固定化條件：戊二醛體積分數為5%，pH 6.0、交聯(lián)時間20 h，每克載體含酶量12 mg。對比研究了游離木瓜蛋白酶和固定化木瓜蛋白酶的性質，所得到的固定化木瓜蛋白酶最適溫度90℃，最適pH 9.0，米氏常數53.6 mg/mL，其熱穩(wěn)定性及耐熱性均較游離酶顯著提高。2001年，王海英等從8種載體材料中選取自制的氨基含量約2.878 mmol/g的甲殼質作為固定化載體，采用吸附交聯(lián)法，以戊二醛為交聯(lián)劑，對木瓜蛋白酶進行固定化。17.5 mg/g的固定化酶/載體比例、pH6、5℃條件下，先吸附10 min，再以體積分數0.7%的戊二醛交聯(lián)12 h，所得固定化酶酶活回收可達52.0%，酶活力為3.54 U/g。固定化酶在65℃以下穩(wěn)定，溶液酶在55℃以下穩(wěn)定；固定化酶在pH 7.0以下穩(wěn)定，溶液酶在pH 6.0以下穩(wěn)定。5℃條件下，固定化酶貯藏半衰期為183 d，以酪蛋白為底物，固定化酶的操作半衰期可達27 d。用固定化酶水解甲殼胺，產物分子量小于100 000的甲殼胺低聚糖得率約為45.55%。2005年，肖寧等以介孔分子篩MCM-41作為載體，戊二醛作為交聯(lián)劑，對木瓜蛋白酶進行了固定化，研究了固定化條件對酶活性及酶活性回收率的影響，并對固定化酶的連續(xù)操作穩(wěn)定性做了初步探討。結果表明：當1 g載體的給酶量為20 mg、固定化溫度10℃～20℃、固定化時間2 h、pH 7.0、戊二醛體積分數0.75%時，木瓜蛋白酶的固定化效果最好，此時酶活性平均回收率達55%左右，固定化酶具有良好的連續(xù)操作穩(wěn)定性，半衰期可達26 d。2007年，黃澤元采用殼聚糖與羧甲基纖維素鈉形成膠囊將木瓜蛋白酶固定化，研究了固定化木瓜蛋白酶的固定化條件。結果表明：在給酶量為50 mg/100mL、殼聚糖質量分數為0.2%、pH7.5、固定化溫度50℃條件下，所得固定化木瓜蛋白酶活力回收率可達69.8%。

4 結論

綜上所述，固定化酶既保持了酶的催化性質，又克服了游離酶的不足之處，具有如下顯著的優(yōu)點。

a.酶的穩(wěn)定性增加，減少溫度、pH、有機溶劑和其他外界因素對酶活力的影響，可以較長期地保持較高的酶活力。

b.固定化酶可反復利用或連續(xù)使用較長的時間，提高酶的利用價值，降低生產成本

c.固定化酶易于和反應產物分開，有利于產物的分離純化，從而提高產品質量。

［1］侯振建.食品添加劑及其應用技術［M］.北京：化學工業(yè)出版社，2004：84.

［2］梁傳偉，張?zhí)K勤.酶工程［M］.北京：化學工業(yè)出版社，2006：68.

［3］高波，朱廣山，付學奇，等.冷凍-真空吸附法在介孔材料中固定木瓜蛋白酶［J］.吉林大學學報，2005，43（6）：29-32.

［4］沈斌，魏榮卿，劉曉寧，等.胺化聚苯乙烯載體柔性固定化木瓜蛋白酶［J］.化工學報，2005，56（6）：1 070-1 075.

［5］王安明，宗璟，王華，等.銀納米粒子在木瓜蛋白酶固定化中的作用［J］.過程工程學報，2007，7（5）：1 018-1 021.

［6］李紅，王煒軍，徐鳳彩.殼聚糖微球固定化木瓜蛋白酶的特性研究［J］.華南農業(yè)大學學報，2001，22（2）：56-58.

［7］劉琳琳，曾力希，劉婷，等.金屬螯合載體定向固定化木瓜蛋白酶的研究［J］.生物工程學報，2005，21（5）：789-793.

［8］何平，黃卓烈，黎春怡，等.海藻酸鈉-殼聚糖固定化木瓜蛋白酶催化內嗎啡肽的合成［J］.中國生物化學與分子生物學報，2008，24（5）：426-431.

［9］王紅玉，高靜，王海鷗.溶膠-凝膠法固定化木瓜蛋白酶的活性保護［J］.過程工程學報，2008，8（6）：1 190-1 194.

［10］李靈玲，張濤，余蓉.可溶性固定化木瓜蛋白酶的制備及性質研究［J］.華西藥學雜志，2007，22（2）：177-179.

［11］王海英，林洪，葉眉，等.固定化木瓜蛋白酶的研究及其應用［J］.青島海洋大學學報，2001，31（5）：689-694.

［12］肖寧，趙炳超，王艷輝，等.介孔分子篩MCM-41固定化木瓜蛋白酶的研究［J］.北京化工大學學報，2005，32（4）41-43.

［13］黃澤元.殼聚糖膠囊法固定化木瓜蛋白酶的研究［J］.食品科技，2002（12）：10-11.

Research progresses on immobilization of papain

LIUJia-jun1，2*LI Bian-sheng1
1（College of Light Industryand Food Engineering，South China Universityof Technology，Guangzhou 510641，China）
2（Department ofFood and Bioengineering，GuangdongIndustryTechnical College，Guangzhou 510300，China）

Papain has a strongabilityofhydrolyzingproteins，but a poor stability，and is difficult torecycle.This paper discussed the immobilization technology of papain in recent years.A fixed papain，with a broad development prospects，not only maintain the enzyme's catalytic properties， but also overcome the shortcomings of the free enzyme.

papain； immobilization；application

TS261.1

A

1673-6004（2011）02-0008-03

*劉嘉俊，男，1982年出生，華南理工大學在職碩士研究生，食品工程專業(yè)，講師。

2011-04-06