根霉ZZ-3脂肪酶發(fā)酵條件的優(yōu)化及酶學(xué)性質(zhì)研究*

魏 濤 封盛雪 毛多斌 魏東芝

（鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，鄭州 450002）

·基礎(chǔ)研究·

根霉ZZ-3脂肪酶發(fā)酵條件的優(yōu)化及酶學(xué)性質(zhì)研究*

魏 濤**封盛雪 毛多斌 魏東芝

（鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，鄭州 450002）

對(duì)根霉ZZ-3脂肪酶產(chǎn)酶條件的優(yōu)化及脂肪酶酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，250 mL三角瓶液體培養(yǎng)，培養(yǎng)基裝液量100 mL，根霉ZZ-3產(chǎn)脂肪酶的最佳培養(yǎng)基為：黃豆粉3 g/100mL，（NH4）2S040.3g/100mL，MgS040.2g/100mL，K2HPO40.2g/100mL，花生油 0.3g/100mL，pH自然。在溫度28℃、轉(zhuǎn)速150 r/min，搖床培養(yǎng)時(shí)間2 d，發(fā)酵酶活力達(dá)到124.60 U/mL。對(duì)該酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了初步研究，該酶最適pH7.5，最適反應(yīng)溫度37℃，在pH7～9、溫度低于40℃條件下酶活穩(wěn)定。

根霉；脂肪酶；產(chǎn)酶條件；酶學(xué)性質(zhì)

脂肪酶（Lipase，EC3.1.1.3，甘油酯水解酶）是一類(lèi)水解或合成長(zhǎng)鏈脂肪酸和甘油形成甘油酯酯鍵的酶，能夠催化水解、酯化、酯交換等多種類(lèi)型反應(yīng)，廣泛應(yīng)用于能源、食品、輕工、有機(jī)合成、醫(yī)藥等領(lǐng)域，具有巨大的商業(yè)和工業(yè)潛在價(jià)值。脂肪酶來(lái)源廣泛，在許多動(dòng)植物及微生物中均存在，而微生物脂肪酶由于種類(lèi)多，作用溫度及pH范圍廣，底物專(zhuān)一性高，易于大量生產(chǎn)及提取等優(yōu)點(diǎn)，成為工業(yè)脂肪酶的重要來(lái)源，常見(jiàn)的產(chǎn)脂肪酶的微生物包括假絲酵母、根霉、青霉、曲霉、毛霉、假單胞菌等。

脂肪酶按其位置專(zhuān)一性分為無(wú)位置專(zhuān)一性和1，3-位置專(zhuān)一性?xún)纱箢?lèi)，其中1，3-位置專(zhuān)一性在酯類(lèi)改性、制備營(yíng)養(yǎng)保健油脂和特種油脂等方面具有重要用途。根霉和毛霉是產(chǎn)生1，3-位置專(zhuān)一性脂肪酶重要菌種。本文對(duì)本室保存根霉ZZ-3產(chǎn)脂肪酶的液體發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，并研究了該脂肪酶酶學(xué)性質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 菌種

根霉ZZ-3，本實(shí)驗(yàn)室選育菌種。

1.2 培養(yǎng)基

斜面種子培養(yǎng)基（馬鈴薯培養(yǎng)基）。

1.3 搖瓶發(fā)酵

根霉ZZ-3斜面于28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d，待其菌絲長(zhǎng)有大量孢子時(shí)，置于4℃冰箱保存。每次接種于250 mL三角瓶（培養(yǎng)基100 mL）中，恒溫?fù)u床培養(yǎng)。搖床設(shè)定28℃、150 r/min，主要探討碳源、氮源、復(fù)合氮源等培養(yǎng)條件對(duì)根霉產(chǎn)脂肪酶的影響。

1.4 酶活測(cè)定

聚乙烯醇橄欖油乳化測(cè)定脂肪酶活力。反應(yīng)溫度37℃，pH7.0緩沖液，以每分鐘水解出1 μmol的脂肪酸所需的酶量定義為一個(gè)脂肪酶活力單位。

1.5 酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定

對(duì)最佳培養(yǎng)條件所產(chǎn)生的脂肪酶進(jìn)行主要酶學(xué)性質(zhì)研究，包括最適溫度、最適pH和熱穩(wěn)定性等。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同碳源對(duì)根霉產(chǎn)脂肪酶的影響

幾種碳源（葡萄糖、蔗糖、糊精、麥芽糖、可溶性淀粉、橄欖油、大豆油、花生油、油酸）對(duì)根霉生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的影響見(jiàn)表1。其中糖葡萄糖對(duì)菌株產(chǎn)脂肪酶最有利，發(fā)酵液酶活為67 U/mL。一般認(rèn)為在培養(yǎng)基中添加油脂可以誘導(dǎo)脂肪酶的產(chǎn)生，我們選擇橄欖油、大豆油、花生油和油酸作為碳源比較研究，發(fā)現(xiàn)橄欖油和花生油產(chǎn)酶量較高，發(fā)酵液酶活達(dá)到60 U/mL以上。由于橄欖油和花生油的油酸含量最高（60 g/100 g～80 g/100 g），油酸可能起到主要誘導(dǎo)作用?？紤]到花生油成本較低，選擇花生油為誘導(dǎo)物。在各種碳源比較時(shí)，高濃度碳源普遍具有抑制作用。

2.2 不同氮源對(duì)根霉產(chǎn)脂肪酶的影響

2.2.1 單一氮源的影響

以葡萄糖作碳源，比較了不同的氮源對(duì)脂肪酶產(chǎn)量的影響，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可見(jiàn)，根霉對(duì)氮源表現(xiàn)出高的選擇性。酵母膏、玉米漿和黃豆粉發(fā)酵液酶活較高，其中黃豆粉達(dá)到80 U/mL；蛋白胨、無(wú)機(jī)氮源（NH4）2S04、NaNO3和尿素發(fā)酵液酶活較低，因此選擇黃豆粉作為發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源物質(zhì)。

表1 不同碳源產(chǎn)脂肪酶的相對(duì)活性U/mL

表2 單一氮源對(duì)酶活的影響 U/mL

2.2.2 復(fù)合氮源的影響

許巖等報(bào)道：對(duì)于根霉產(chǎn)脂肪酶，復(fù)合氮源優(yōu)于單一氮源。因此我們考察了復(fù)合氮源（有機(jī)氮源復(fù)合和有機(jī)氮源與無(wú)機(jī)氮源復(fù)合）對(duì)根霉ZZ-3產(chǎn)酶的影響，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。有機(jī)氮源復(fù)合效果不明顯，有機(jī)氮源和無(wú)機(jī)氮源（NH4）2S04復(fù)合可獲得較高的酶活，可達(dá)到100 U/mL，對(duì)發(fā)酵液酶活有較明顯的促進(jìn)作用。原因可能是無(wú)機(jī)氮源銨態(tài)氮是根霉產(chǎn)脂肪酶的必要離子。

表3 復(fù)合氮源對(duì)酶活的影響 U/mL

2.3 培養(yǎng)基正交試驗(yàn)優(yōu)化

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取黃豆粉、（NH4）2S04、MgS04、K2HPO44個(gè)因素進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)以?xún)?yōu)化培養(yǎng)基組成，正交試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表4，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。

表4 正交試驗(yàn)因素水平表

表5 培養(yǎng)基正交實(shí)驗(yàn)

從極差結(jié)果得出影響酶活的因素大小為RA＞RD＞RC＞RB， 即 黃 豆 粉 ＞K2HPO4＞（NH4）2S04＞MgS04。最佳組合為A3B1C2D1。優(yōu)化培養(yǎng)基最優(yōu)組成為黃豆粉3g/100mL，（NH4）2S040.3g/100mL，MgS040.2g/100mL，K2HPO40.2 g/100mL，花生油0.3 g/100mL，pH自然，在28℃、轉(zhuǎn)速150 r/min，250 mL三角瓶（培養(yǎng)基100 mL） 搖床培養(yǎng)時(shí)間2 d，發(fā)酵酶活力達(dá)到124.60 U/mL。

2.4 酶的性質(zhì)研究

2.4.1 熱穩(wěn)定性

取100 mL粗酶液置于不同溫度下，每隔20 min取樣測(cè)定酶活性，結(jié)果如圖1。37℃下酶活比較穩(wěn)定，40℃處理80 min酶活損失50%，50℃酶活幾乎完全損失。

2.4.2 pH穩(wěn)定性

取100 mL粗酶液，加入等體積的pH（pH5.0、6.0、7.0、8.0） 不同的緩沖液，隔一定時(shí)間測(cè)定酶活，結(jié)果見(jiàn)圖2。在pH5.0～8.0根霉脂肪酶酶活比較穩(wěn)定，其中在中性和偏堿性更穩(wěn)定。pH8.0，處理60 h酶活力能夠維持在90%以上。

圖1 酶的熱穩(wěn)定性

圖2 酶的pH穩(wěn)定性

2.4.3 最適反應(yīng)溫度

測(cè)定了33℃～47℃范圍內(nèi)該根霉脂肪酶的相對(duì)酶活力，結(jié)果見(jiàn)圖3。在37℃時(shí)，該酶表現(xiàn)出最高酶活力；在33℃和47℃，該酶酶活最低，與酶的熱穩(wěn)定性相一致。

圖3 溫度對(duì)酶活的影響

2.4.4 最適反應(yīng)pH

配制一系列pH不同的緩沖液，測(cè)定根霉所產(chǎn)脂肪酶的最適pH值。試驗(yàn)測(cè)定了該脂肪酶在pH6.0～9.0范圍內(nèi)相對(duì)酶活，結(jié)果見(jiàn)下頁(yè)圖4，脂肪酶的最適pH為7.5。

3 結(jié)論

圖4 pH對(duì)酶活的影響

根霉ZZ-3產(chǎn)脂肪酶最佳培養(yǎng)基為：黃豆粉3g/100mL，（NH4）2S040.3g/100mL，MgS040.2g/100mL，K2HPO40.2 g/100mL，花生油 0.3 g/100 mL，pH自然。在溫度28℃、搖床轉(zhuǎn)速150 r/min，250 mL三角瓶裝液量100 mL，培養(yǎng)時(shí)間2 d，發(fā)酵液酶活力達(dá)到124.60 U/mL。有機(jī)氮源和無(wú)機(jī)氮源復(fù)合可獲得較高的酶活，而有機(jī)氮源復(fù)合效果不大。油酸具有較好的誘導(dǎo)效果。該脂肪酶最適pH7.5，最適反應(yīng)溫度37℃，在pH7～9、溫度低于40℃表現(xiàn)穩(wěn)定。對(duì)根霉ZZ-3所產(chǎn)脂肪酶的酶學(xué)性質(zhì)研究表明，該酶在食品、醫(yī)藥和油酯化工等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

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Production conditions and enzymatic properties of lipase from rhizopus ZZ-3

WEI Tao*FENGSheng-xue MAODuo-bin WEI Dong-zhi
（College offood science and engineering，Shanxi agricultural university，Taigu 030801，China）

In this paper the production conditions of lipase from Rhizopus ZZ-3 were optimized and its enzymatic properties were studied.The results indicated that the suitable conditions for lipase production from Rhizopus were as the follows： soypowder 3 g/100mL，（NH4）2S040.3 g/100mL，MgS040.2 g/100mL，K2HPO40.2 g/100mL，soybean 0.3 g/100mL，pH natural.The highest lipase activity was 124.60 U/mL on the condition of 28℃，150 r/min.The properties of the lipase was also characterized.The optimal temperature and pH of lipase was 37℃and 7.5.The lipase was relativelystable in pH range of7-9 and at 40℃.

rhizopus；lipase；productions oflipase；enzymatic properties

TS201.2+5

A

1673-6004（2011）02-0020-04

* 項(xiàng)目資助：河南省重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目資助（102102210063）；鄭州輕工業(yè)學(xué)院博士科研基金（000544）。

**魏濤，男，1980年出生，2008年畢業(yè)于山東大學(xué)微生物學(xué)專(zhuān)業(yè)，講師。

2011-03-25