張海紅，曹家松，劉 歡，王永明，黃國偉

（天津醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)教研室，天津300070）

同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）是蛋氨酸代謝的重要中間產(chǎn)物，高同型半胱氨酸血癥（hyperhomocysteine，HHcy）被確立為心腦血管疾病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病的一個重要獨立危險因子，在疾病的發(fā)生發(fā)展過程中具有直接的作用[1]。葉酸是Hcy循環(huán)過程中重要的輔助因子，葉酸水平的升高可促進Hcy的再甲基化代謝，從而降低血漿中Hcy水平。葉酸缺乏與大腦的學(xué)習(xí)記憶功能減退存在關(guān)聯(lián)[2]，是認(rèn)知功能障礙的又一危險因素。近年來，葉酸對神經(jīng)系統(tǒng)的保護作用已成為研究熱點，但葉酸的具體作用機制尚不完全清楚。本研究通過高蛋氨酸飲食制備大鼠HHcy模型，并予以葉酸干預(yù)，探討Hcy對大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響及葉酸干預(yù)的效果，觀察葉酸是否能夠通過降低Hcy水平提高大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 雄性Sprague-Dawley大鼠，24只，體重250～280 g。購自天津市山川紅實驗動物科技有限公司[許可證號 scxk（津）2009-0001]。

1.1.2 試劑 L-蛋氨酸（分析純）、葉酸（美國Sigma公司進口分裝）購自天津市聯(lián)星生物技術(shù)有限公司。大鼠Hcy ELISA試劑盒（美國RD進口分裝）購自廈門慧嘉生物科技有限公司。

1.1.3 儀器 Morris水迷宮為中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所產(chǎn)品。

1.2 研究方法 實驗前，將大鼠自由飼養(yǎng)2周，以適應(yīng)實驗室環(huán)境。將大鼠隨機分為3組，每組8只，分別為正常組、蛋氨酸組、蛋氨酸+葉酸組。正常組給予普通飼料喂養(yǎng)，蛋氨酸組、蛋氨酸+葉酸組給予添加3%蛋氨酸飼料喂養(yǎng)，同時正常組和蛋氨酸組每天給予0.8 mg/（kg·bw）生理鹽水灌胃，蛋氨酸+葉酸組每天給予0.8 mg/（kg·bw）葉酸灌胃。分別于實驗前（第0周）、干預(yù)后4周、8周、12周、16周內(nèi)眥靜脈取血測定血漿Hcy濃度。并于16周后采用Morris水迷宮對大鼠進行行為學(xué)檢測。

1.2.1 血漿Hcy測定 大鼠內(nèi)眥靜脈血1 mL，10%肝素鈉抗凝，3000 r/min離心10 min，取上清液（血漿），使用大鼠Hcy ELISA試劑盒進行檢測，具體操作步驟嚴(yán)格遵照說明書要求進行。

1.2.2 Morris水迷宮檢測大鼠學(xué)習(xí)記憶能力 Morris水迷宮為直徑150 cm、高50 cm圓形水池，水池內(nèi)壁為黑色，池內(nèi)水深25 cm，實驗時用墨水將水染成黑色，以利于捕捉大鼠運動軌跡，水溫保持在（25±1）℃，房間內(nèi)光照恒定，池壁上以4個等距離點將水池分為4個象限，在第一象限內(nèi)距離池壁32.5 cm處放有直徑為10 cm、高24 cm的圓形黑色平臺，平臺位于水面下1 cm。池壁4個象限分別貼有不同的標(biāo)記物。池壁向中心15 cm處畫圓，再向中心15 cm畫圓，外環(huán)為20%邊緣區(qū)域，中環(huán)為40%邊緣區(qū)域，內(nèi)環(huán)為中心區(qū)域（具體區(qū)域劃分見圖1）。迷宮上方安置連接顯示系統(tǒng)的攝像機，同步記錄大鼠運動軌跡。

圖1 水迷宮區(qū)域劃分圖Fig 1 Water maze zoning map

1.2.2.1 定位航行實驗：實驗前1 d，讓大鼠熟悉水迷宮環(huán)境，平臺在第1象限內(nèi)。第2天開始正式實驗，實驗歷時5 d，每天分別于上午和下午各進行4次訓(xùn)練，分別從Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ象限池壁中心位置的4個點入水，將大鼠面部背向站臺沿池壁放入水中，記錄其搜尋平臺的時間即逃避潛伏期。如大鼠在120 s內(nèi)未找到平臺，則將其引向平臺，并使其在平臺上停留30 s，此時其潛伏期記為120 s，測試過程中保持實驗室內(nèi)光照、物品等外界條件及空間參照物擺放位置不變，以排除外界條件干擾。

1.2.2.2 空間探索實驗：實驗第6天，撤走平臺，任選一個入水點，將大鼠面向池壁放入水中，記錄大鼠在120 s內(nèi)的游泳軌跡，第一次穿越平臺的時間，120 s內(nèi)穿越平臺的次數(shù)及在20%邊緣區(qū)域、40%邊緣區(qū)域、中心區(qū)域停留的時間百分比，并根據(jù)大鼠在水中搜索站臺的游泳軌跡確定其每次的搜索策略，以此判斷大鼠的記憶能力。搜索方式分為趨向式、隨機式、邊緣式3種方式，根據(jù)大鼠入水后尋找目標(biāo)區(qū)域的游泳軌跡來確定。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件，大鼠血漿Hcy濃度、Morris水迷宮的逃避潛伏期時間采用重復(fù)測量方差分析，其它采用單因素方差分析，數(shù)據(jù)以±s表示，檢驗水準(zhǔn) α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 血漿Hcy濃度 重復(fù)測量方差分析表明，實驗數(shù)據(jù)具有顯著的時間和組間效應(yīng)，按不同時間點分析，隨著給藥周數(shù)的增加，蛋氨酸組大鼠血漿Hcy濃度呈上升趨勢（P<0.05）。按照不同處理組分析，與正常組比校，蛋氨酸組大鼠血漿Hcy濃度值在第8周、第12周和第16周均高于正常組，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），與蛋氨酸組比較，蛋氨酸+葉酸組有所下降（P<0.05），具體結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠血漿Hcy濃度比較（n=8,±s，μmol/L）Tab 1 The comparison of plasma Hcy concentrations of rats in each group（n=8,±s，μmol/L）

表1 各組大鼠血漿Hcy濃度比較（n=8,±s，μmol/L）Tab 1 The comparison of plasma Hcy concentrations of rats in each group（n=8,±s，μmol/L）

與正常組比較*P<0.05；與蛋氨酸組比較#P<0.05；與第0周比較△P<0.05；與第 8 周比較★P<0.05

組別正常組蛋氨酸組蛋氨酸+葉酸組第4周9.09±0.809.82±1.208.51±1.11第0周9.06±1.419.10±1.658.28±1.70第8周8.89±1.1411.40±0.48*8.62±0.86#第12周9.25±0.7615.10±0.37*△★8.83±0.81#第16周9.18±0.7817.54±0.11*△★9.08±0.41#

2.2 Morris水迷宮定位航行實驗潛伏期結(jié)果 重復(fù)測量方差分析表明，Morris水迷宮定位航行實驗的數(shù)據(jù)具有顯著的時間和組間效應(yīng)，提示在測試期間，各組大鼠尋找平臺的潛伏期時間隨著訓(xùn)練天數(shù)增加呈顯著性下降趨勢（P＜0.05），通過組間比較，在定位航行第1天、第5天，大鼠各組間逃避潛伏期未見明顯差異；定位航行第2天、第3天和第4天，蛋氨酸組潛伏期長于正常組（P<0.05），蛋氨酸+葉酸組較蛋氨酸組縮短（P<0.05），從整個定位航行實驗結(jié)果看，各組大鼠雖然在第5天的潛伏期無明顯差異，但第2天、3天、4天的學(xué)習(xí)過程中出現(xiàn)顯著性差異，正常組和蛋氨酸+葉酸組的潛伏期縮短較快且比較穩(wěn)定，蛋氨酸組則較弱，說明蛋氨酸組大鼠獲得記憶能力的時間要長于正常組，蛋氨酸+葉酸組大鼠獲得記憶能力的時間短于蛋氨酸組。具體結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠定位航行實驗平均逃避潛伏期時間（n=8,±s，s）Tab 2 The mean escape latency in place navigation test of rats in each group（n=8,±s，s）

表2 各組大鼠定位航行實驗平均逃避潛伏期時間（n=8,±s，s）Tab 2 The mean escape latency in place navigation test of rats in each group（n=8,±s，s）

與正常組比較*P<0.05；與蛋氨酸組比較#P<0.05；與第1天比較△P<0.05；與第2天比較★P<0.05

組別正常組蛋氨酸組蛋氨酸+葉酸組第2天77.71±16.86△92.94±15.52*△65.90±16.47#△第3天43.24±9.59△★67.76±16.43*△★41.72±7.44#△★第4天31.60±11.25△★45.74±13.31*△★27.66±7.75#△★第5天14.33±5.85△★17.00±6.17△★14.67±8.31△★第1天93.51±16.23★107.10±10.19★98.22±13.77★

2.3 Morris水迷宮空間探索實驗結(jié)果 與正常組相比，蛋氨酸組大鼠在第Ⅰ象限內(nèi)停留時間、穿越平臺次數(shù)、40%邊緣區(qū)域停留時間減少，第一次穿越目標(biāo)區(qū)時間、20%邊緣區(qū)域停留時間、路徑長度增長（P<0.05）；與蛋氨酸組相比，蛋氨酸+葉酸組在第Ⅰ象限內(nèi)停留時間、穿越平臺次數(shù)、40%邊緣區(qū)域停留時間增多，第一次穿越目標(biāo)區(qū)時間、20%邊緣區(qū)域停留時間、路徑長度減少（P<0.05）。從120 s內(nèi)的游泳軌跡圖（圖2）中可以看出，各組大鼠尋找平臺的搜索策略和游泳路徑也有所不同，正常組、蛋氨酸+葉酸組大鼠通過趨向式的搜索方式向著平臺所在區(qū)域?qū)ふ移脚_，游泳路徑相一致，蛋氨酸組則通過隨機式的搜索方式在各象限尋找平臺，游泳路徑表現(xiàn)出明顯差異，綜合整個空間探索實驗，蛋氨酸組大鼠記憶保持能力降低，蛋氨酸+葉酸組大鼠記憶保持能力得到改善。具體結(jié)果見表3、4。

表3 各組大鼠空間探索實驗結(jié)果Tab 3 The results of spatial probe test of rats in each group

表4 各組大鼠在不同區(qū)域停留的時間百分比（%）Tab 4 The percentage of time spent on different region of rats in each group（%）

圖2 各組大鼠空間探索實驗軌跡圖Fig 2 The tracing image of spatial probe test of rats in each group

3 討論

葉酸是Hcy代謝過程中重要的甲基供體，葉酸缺乏時，就會產(chǎn)生HHcy血癥，有研究發(fā)現(xiàn)，高濃度的葉酸攝入可有效的降低阿爾茨海默?。ˋD）的發(fā)病率或延緩病情的發(fā)生發(fā)展[3-4]。

Alagidisa等[5]通過給成年大鼠注射Hcy，第14周進行水迷宮測試時出現(xiàn)差異。Baydas等[6]通過促黑素可降低血漿Hcy水平，并改善大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。通過給予大鼠高蛋氨酸飼料，成功建立HHcy模型，并予以葉酸灌胃干預(yù)，通過Morris水迷宮實驗的定位航行實驗和空間探索實驗中各項指標(biāo)，多方位、多角度，全面跟蹤分析大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的變化情況。Morris水迷宮是實驗動物在水中尋找隱藏平臺并通過分析其尋找平臺所用時間和所走路徑判斷其記憶功能好壞的實驗方案，是一種研究空間學(xué)習(xí)記憶的標(biāo)準(zhǔn)實驗[7]。通過各項結(jié)果顯示，蛋氨酸組大鼠血漿Hcy水平隨著干預(yù)時間延長高于正常組（P<0.05），蛋氨酸+葉酸組的血漿Hcy水平低于蛋氨酸組，說明通過葉酸的干預(yù)可以促進體內(nèi)Hcy代謝，降低血漿中Hcy的水平。定位航行實驗結(jié)果表明體內(nèi)Hcy的升高對大鼠獲取學(xué)習(xí)記憶能力有一定的影響，通過補充葉酸可以提高大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。空間探索實驗結(jié)果證明體內(nèi)Hcy的升高對大鼠保持記憶能力有損傷作用，補充葉酸可以改善大鼠保持記憶的能力。

本實驗通過行為學(xué)檢測表明，血漿中Hcy含量升高對大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力減退有一定的影響，提示通過早期補充葉酸可以降低血漿中的Hcy濃度，并改善學(xué)習(xí)記憶能力。關(guān)于葉酸改善學(xué)習(xí)記憶的機制，目前尚處在研究初期階段，筆者之前的實驗發(fā)現(xiàn)，補充葉酸能夠促進體外培養(yǎng)的大鼠神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化，并能促進成年動物缺氧損傷的中樞神經(jīng)系統(tǒng)進行生長、修復(fù)[8-10]，但葉酸對認(rèn)知功能的具體作用機制還有待從分子水平進一步深入探討。

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