張輝，宋永勝，吳斌

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院泌尿外科，沈陽(yáng) 110001）

腎癌是泌尿系中最常見的惡性腫瘤之一，僅次于膀胱腫瘤，約占腎臟惡性腫瘤的85%。既往腎癌就診時(shí)20%～35%已有轉(zhuǎn)移，6%～15%是因?yàn)檗D(zhuǎn)移癥狀而就診［1］，因此加強(qiáng)對(duì)腎癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制的研究尤為重要。KISS-1基因是一個(gè)重要的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，能明顯抑制腫瘤細(xì)胞的化學(xué)趨向性和侵襲性，并限制腫瘤細(xì)胞的遷移、蠕動(dòng)功能［2］。本研究擬應(yīng)用實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)KISS-1基因和上皮細(xì)胞鈣粘蛋白（epithelia cadherin，E-cadherin）在腎癌中的表達(dá)，并研究KISS-1對(duì)腎癌細(xì)胞Caki-1中E-cadherin的調(diào)控作用。

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2011-09-26 12:08

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

所有組織標(biāo)本均來(lái)源于2007-2010年中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院泌尿外科患者，包括53例原發(fā)未轉(zhuǎn)移腎癌和46例原發(fā)伴轉(zhuǎn)移腎癌?；颊吣挲g47～63歲，行經(jīng)腹腔根治性腎切除術(shù)，經(jīng)病理診斷證實(shí)為腎透明細(xì)胞癌，均未接受放療和化療。組織標(biāo)本切除后浸入RNAlater，放入-80℃冰箱中保存。人腎癌細(xì)胞系Caki-1為本實(shí)驗(yàn)室保存；重組真核表達(dá)載體pIRES2-KISS1為本實(shí)驗(yàn)室前期研究構(gòu)建。總RNA抽提試劑TRIZOL和轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamin 2000購(gòu)自Invitrogen公司，大腸埃希菌DH5α、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)PCR試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司，無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒中提試劑盒購(gòu)自北京天根公司，抗KISS-1和E-cadherin抗體購(gòu)自Abcam公司，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗購(gòu)自北京中山公司，Western blot相關(guān)試劑購(gòu)自上海碧云天公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)時(shí)PCR：TRIZOL法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以β-actin為內(nèi)參基因，按照試劑盒說(shuō)明書擴(kuò)增KISS-1和 E-cadherin基因，KISS-1上游引物：5′-TTCCTCTGTGCCACCCACTT-3′， 下 游 引 物 ：5′-GCAGTAGCAGCTGGCTTCCT-3′；E-cadherin 上游引物：5′-GCTTCCCTCTTTCATCTCCT-3′，下游引物：5′-TAGTTCCGCTCTGTCTTTGG-3′。應(yīng)用 ABI公司的7500 Real-time PCR儀，7500 Software v2.0軟件。實(shí)驗(yàn)獲得數(shù)據(jù)采用比較CT值法（2-ΔΔCT法）進(jìn)行相對(duì)定量分析。計(jì)算公式：（1）改變的倍數(shù)＝2-ΔΔCT；（2）ΔΔCT＝ΔCT腫瘤組-ΔCT癌旁組；（3）ΔCT＝CT靶基因-CT內(nèi)參。結(jié)果為相對(duì)于對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組中靶基因的表達(dá)相對(duì)于內(nèi)參的改變倍數(shù)。

1.2.2 提取無(wú)內(nèi)毒素重組載體：將表達(dá)載體pIRES2-KISS-1轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α，接種于含有100 μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，收集菌液，采用無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒中提試劑盒，按照說(shuō)明書抽提無(wú)內(nèi)毒素重組載體。

1.2.3 載體轉(zhuǎn)染：Caki-1細(xì)胞以5×104/孔轉(zhuǎn)種于6孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)至細(xì)胞80%～90%融合。按轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞進(jìn)行Western blot檢測(cè)。

1.2.4 Western blot：未轉(zhuǎn)染的Caki-1細(xì)胞為空白對(duì)照組，轉(zhuǎn)染pIRES2的Caki-1細(xì)胞為陰性對(duì)照組，轉(zhuǎn)染pIRES2-KISS1的Caki-1細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組。提取待測(cè)細(xì)胞蛋白，定量，行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后將PVDF膜先后與一抗和二抗孵育，與ECL發(fā)光底物結(jié)合后顯影、成像。經(jīng)GDS凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行光密度分析，目的條帶的光密度與內(nèi)參蛋白β-actin的光密度的比值即為目的蛋白表達(dá)的相對(duì)值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)腎癌組織中KISS-1和E-cadherin mRNA的表達(dá)

通過(guò)引物溶解曲線分析，KISS-1基因擴(kuò)增成功。結(jié)果顯示，KISS-1mRNA在原發(fā)未轉(zhuǎn)移腎癌和原發(fā)伴轉(zhuǎn)移腎癌組織中的△CT分別為4.372±0.518與 5.841±0.487，ΔΔCT為 1.469，伴轉(zhuǎn)移組中 KISS-1 mRNA較未轉(zhuǎn)移組明顯下調(diào)，為未轉(zhuǎn)移組表達(dá)量的36.1%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。而E-cadherin mRNA 的△CT分別為 3.647±0.438與 4.904±0.548，ΔΔCT為 1.257，E-cadherinmRNA 在伴轉(zhuǎn)移組中表達(dá)明顯下調(diào)，為未轉(zhuǎn)移組表達(dá)量的41.8%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.2 KISS-1和E-cadherin的相關(guān)性分析

通過(guò)Pearson相關(guān)分析，KISS-1和E-cadherin的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.735，P<0.05）。

2.3 Western blot檢測(cè) RNA干擾Caki-1細(xì)胞中KISS-1和E-cadherin蛋白的表達(dá)

空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中KISS-1蛋白的相對(duì)表達(dá)分別為0.473±0.052、0.446±0.048和1.138±0.074，E-cadherin蛋白的相對(duì)表達(dá)分別為 0.564±0.061、0.587±0.068 和 1.263±0.087（圖1）。與空白和陰性對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中KISS-1和E-cadherin蛋白的表達(dá)均明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

3 討論

KISS-1基因是由Lee等［3］在人類黑色素細(xì)胞株中發(fā)現(xiàn)的一種腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，定位于染色體1q32-q41。KISS-1基因能明顯抑制腫瘤細(xì)胞的化學(xué)趨向性和侵襲性，并限制腫瘤細(xì)胞的遷移蠕動(dòng)功能［2］。KISS-1基因在乳腺癌和胃癌等多種腫瘤中存在轉(zhuǎn)移抑制作用［4，5］。最新的研究表明，KISS-1 基因高表達(dá)在膽囊癌和胰腺癌患者中均有較好的預(yù)后［6，7］。本研究應(yīng)用實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與原發(fā)未轉(zhuǎn)移腎癌相比，KISS-1mRNA在原發(fā)伴轉(zhuǎn)移腎癌組織中的表達(dá)明顯下調(diào)。KISS-1基因與腎癌的轉(zhuǎn)移相關(guān)，可能在腎癌的轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮抑制作用。我們前期的細(xì)胞水平研究發(fā)現(xiàn)，沉默腎癌769-P細(xì)胞中KISS-1基因的表達(dá)能夠增強(qiáng)769-P細(xì)胞的侵襲能力［8］。因此，研究證實(shí)KISS-1基因在腎癌中具有抑制腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的功能。

E-cadherin屬于鈣粘蛋白家族，它廣泛存在于各類上皮細(xì)胞中，通過(guò)胞漿連環(huán)蛋白與細(xì)胞骨架蛋白相連，是介導(dǎo)細(xì)胞之間以及細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)粘附的主要分子之一［9］。有研究報(bào)道，E-cadherin由于啟動(dòng)子區(qū)甲基化等原因造成的表達(dá)下調(diào)，與多種腫瘤的轉(zhuǎn)移相關(guān)［10，11］。本研究發(fā)現(xiàn)，與原發(fā)未轉(zhuǎn)移腎癌相比，E-cadherinmRNA在原發(fā)伴轉(zhuǎn)移腎癌組織中的表達(dá)明顯升高。E-cadherin基因與腎癌的轉(zhuǎn)移相關(guān)。進(jìn)一步的統(tǒng)計(jì)分析顯示，在全部的腎癌組織中KISS-1和E-cadherin的表達(dá)呈正相關(guān)，二者之間可能有內(nèi)在的調(diào)控關(guān)系。

我們將表達(dá)載體pIRES2-KISS1轉(zhuǎn)染腎癌Caki-1細(xì)胞，上調(diào)其中KISS-1蛋白的表達(dá)，Western blot檢測(cè)證實(shí)E-cadherin蛋白顯著上調(diào)。腎癌細(xì)胞中KISS-1和E-cadherin存在正性調(diào)控的關(guān)系，KISS-1的表達(dá)改變能夠影響E-cadherin的表達(dá)。綜上所述，我們認(rèn)為KISS-1基因能夠通過(guò)上調(diào)E-cadherin的表達(dá)發(fā)揮其腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因的作用，進(jìn)一步的深入探討將為研究腎癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制提供新的理論依據(jù)，而且能夠?yàn)槟I癌的治療提供新靶點(diǎn)。

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