吡柔比星聯(lián)合干擾素抑制大鼠膀胱癌生長的機(jī)制

姜華茂，傅德望，司淑斌，宋斌，張春陽

（遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院泌尿外科，遼寧 錦州 121001）

膀胱癌行經(jīng)尿道膀胱腫瘤切除術(shù)后仍有較高的復(fù)發(fā)率和進(jìn)展率［1］。單純經(jīng)尿道膀胱腫瘤切除術(shù)不能解決術(shù)后高復(fù)發(fā)和進(jìn)展問題，膀胱灌注是膀胱癌術(shù)后治療的重要方面［2］。多藥耐藥發(fā)生是膀胱腔內(nèi)化療失敗的重要原因，而聯(lián)合其他藥物是減少多藥耐藥、增強(qiáng)膀胱灌注療效的重要方法。吡柔比星和干擾素α-2b膀胱灌注對經(jīng)尿道膀胱腫瘤切除術(shù)后都有一定療效［3～5］。本研究通過動物實(shí)驗(yàn)觀察吡柔比星聯(lián)合干擾素α-2b膀胱灌注對大鼠膀胱癌的作用，并初步探討其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物和分組：雌性Wistar大鼠80只，10～12 周齡，體質(zhì)量（200±20）g，購自遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心。大鼠隨機(jī)分為對照組、吡柔比星組、干擾素組和聯(lián)合用藥組，每組20只。

1.1.2 主要試劑與設(shè)備：N-甲基-N-亞硝基脲（N-methyl-N-nitrosourea，MNU，Sigma公司），以 pH6.0的枸櫞酸緩沖液配成濃度為20 mg/mL的溶液；鹽酸吡柔比星（深圳萬樂藥業(yè)有限公司），以注射用水配制成1.0 mg/mL吡柔比星溶液；注射用重組干擾素α-2b（安徽安科生物工程集團(tuán)股份有限公司），以注射用水配制成濃度為30萬IU/mL溶液；聯(lián)合用藥組中吡柔比星和重組干擾素α-2b濃度與各單一用藥組一致。兔抗大鼠CD34抗體（武漢博士德生物公司）；SABC免疫組化染色試劑盒（武漢博士德生物公司）；DAB顯色試劑盒（武漢博士德生物公司）；CD34兔抗大鼠單克隆抗體試劑盒（Santa Cruz公司）；Annexin V細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（北京寶賽生物技術(shù)有限公司）。BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀（Becton Dickinson公司）；Autostainer plus全自動免疫組化染色儀（丹麥DAKO公司）；CIAS-1000型細(xì)胞圖像分析系統(tǒng)（北京大恒圖像視覺有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 膀胱癌模型制作和用藥：MNU溶液0.2 mL每周1次膀胱灌注，誘導(dǎo)大鼠膀胱癌。對照組、吡柔比星組、干擾素組和聯(lián)合用藥組大鼠于首次灌注MNU后第8周，分別行生理鹽水0.5 mL、吡柔比星溶液0.5 mL、重組干擾素α-2b溶液0.5 mL和吡柔比星+重組干擾素α-2b溶液0.5 mL膀胱灌注，每周1次，共6次。

1.2.2 病理觀察：灌注MNU后第8周，每組隨機(jī)抽取2只大鼠，處死后解剖膀胱，觀察膀胱內(nèi)情況后常規(guī)制作光鏡切片，HE染色，病理觀察。第14周處死其余大鼠，切取膀胱，稱膀胱質(zhì)量。選取一塊最大膀胱腫瘤制作石蠟標(biāo)本塊，切片，HE染色，進(jìn)行病理觀察。

1.2.3 免疫組化檢測：石蠟標(biāo)本塊切片，厚4 μm，免疫組織化學(xué)方法以CD34標(biāo)記微血管。在不知實(shí)驗(yàn)和病理特征的單盲情況下，由專業(yè)病理人員先在40倍和100倍鏡下掃視整個切片，尋找新生血管熱點(diǎn)區(qū)，400倍鏡下計(jì)數(shù)染成棕黃色的血管數(shù)目，以5個視野下血管數(shù)目的平均值表示微血管密度（microvessel densitiy，MVD）。被CD34染成棕黃色的血管內(nèi)皮，若與鄰近微血管、腫瘤細(xì)胞或其他結(jié)締組織分開即視為一個微血管，只要結(jié)構(gòu)不相連其分支結(jié)構(gòu)也作為一個血管。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測：切取各組病理取材后的腫瘤組織，PBS漂洗，用眼科剪反復(fù)剪碎組織，200目不銹鋼篩研磨過濾，并不斷以PBS沖洗，吸取濾過的單細(xì)胞懸液置離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄上清，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL，以Annexin V細(xì)胞凋亡檢測試劑盒檢測凋亡指數(shù)（apoptotic index，AI）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠存活情況和一般狀態(tài)觀察

大鼠在膀胱灌注后2.0～2.5 h排尿，3.0～4.0 h后恢復(fù)活動，誘癌期間各組大鼠毛色、食量、營養(yǎng)狀況及體質(zhì)量等一般情況無明顯差別。實(shí)驗(yàn)過程中共有63只大鼠存活，其中對照組17只、吡柔比星組16只、干擾素組14只、聯(lián)合用藥組16只。

2.2 病理學(xué)觀察

第8周時，可見膀胱內(nèi)微小結(jié)節(jié)和突起；光鏡下移行上皮細(xì)胞層數(shù)增多，排列紊亂，核染色質(zhì)為顆粒狀，分布不均勻，可見核分裂像，為不典型增生和移行細(xì)胞Ⅰ級（圖1A）。第14周時，各組大鼠膀胱均可見菜花狀、多發(fā)、大小不一的腫物；光鏡下膀胱黏膜細(xì)胞大小不一，細(xì)胞層數(shù)明顯增多，排列非常紊亂，極向消失，核大不規(guī)則，核膜增厚，核仁肥大，核質(zhì)比例增大，核分裂像明顯，可見不同級別的腫瘤組織，并侵入肌層（圖1B）。

2.3 各組大鼠膀胱的質(zhì)量

吡柔比星組和聯(lián)合用藥組大鼠膀胱質(zhì)量小于對照組（P<0.01），聯(lián)合用藥組大鼠膀胱質(zhì)量小于吡柔比星組（P<0.05），干擾素組大鼠膀胱質(zhì)量與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表1。

2.4 各組的MVD

3個實(shí)驗(yàn)組大鼠膀胱腫瘤的MVD均小于對照組（P<0.01）。聯(lián)合用藥組MVD小于干擾素組（P<0.01），而與吡柔比星組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P> 0.05），見圖2、表1。

表1 各組大鼠膀胱的質(zhì)量、M VD和AI（±s）Tab.1 The w ei ght s ofbl adders，M VD and AIofal lrat s（±s）Group n Weight of bladder（mg） MVD AI（%）Control 15 294.0±9.9 28.5±5.6 6.56±2.35 Pirarubicin 14 274.4±13.22） 9.8±3.12） 13.16±5.772）Interferon 12 295.3±8.2 21.1± 4.42） 11.5±4.01）Combination 14 265.7±11.72），3），5） 8.5±2.12），5） 22.7±8.22），4），5）1）P ＜ 0.05，2）P ＜ 0.01 vs control group；3）P ＜ 0.05，4）P ＜ 0.01 vs pirarubicin group；5）P ＜ 0.05 vs interferon group.

2.5 各組的AI

聯(lián)合用藥組大鼠的AI值高于其他3組（P<0.01），吡柔比星組和干擾素組的AI大于對照組（P分別<0.01和 0.05），見表1。

3 討論

用MNU誘癌法建立膀胱原位癌模型具有誘癌周期相對短、膀胱選擇性強(qiáng)、誘癌率高等優(yōu)點(diǎn)，MNU誘發(fā)的膀胱腫瘤與人類膀胱癌的組織學(xué)和生物學(xué)行為類似，適用于對藥物治療效果的評價［6］。本實(shí)驗(yàn)中各組大鼠均誘癌成功，死亡17只（17/80），在第1次誘導(dǎo)后第8周大鼠膀胱黏膜出現(xiàn)早期腫瘤表現(xiàn)，而在第14周膀胱腫瘤已呈多方和肌層浸潤性改變。由于腫瘤的生長，大鼠膀胱質(zhì)量增加，其中對照組膀胱質(zhì)量較大，而吡柔比星組和聯(lián)合用藥組膀胱質(zhì)量較?。≒<0.01），表明膀胱腫瘤的生長受到抑制。干擾素組的MVD低于對照組且AI高于對照組，表明干擾素可抑制腫瘤生長和促進(jìn)凋亡，但干擾素組膀胱質(zhì)量與對照組相近（295.3和294.0 mg），可能與干擾素膀胱灌注導(dǎo)致膀胱炎性改變有關(guān)。

吡柔比星是一種半合成的蒽環(huán)類抗癌藥，它能迅速進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)，在S期通過直接嵌入DNA核酸堿基對間，干擾轉(zhuǎn)錄過程，終止細(xì)胞周期，使腫瘤細(xì)胞凋亡，故具有較強(qiáng)的抗癌活性。有研究表明，吡柔比星膀胱內(nèi)灌注后膀胱癌組織有較高濃度聚集，而正常膀胱組織黏膜層只有少量吡柔比星，并且膀胱腫瘤細(xì)胞的AI顯著高于對照組［7］。本研究也證實(shí)了吡柔比星促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞凋亡的作用，并且吡柔比星膀胱灌注后膀胱腫瘤的MVD也明顯降低，這表明吡柔比星膀胱灌注抑制膀胱腫瘤生長的機(jī)制可能與抑制腫瘤血管生成有關(guān)。

重組干擾素α-2b具有廣譜抗病毒、抗腫瘤、抑制細(xì)胞增殖以及提高免疫功能等作用。單獨(dú)應(yīng)用干擾素α-2b治療膀胱腫瘤效果不佳，但與卡介苗等聯(lián)合應(yīng)用可取得較好的療效［3，4］。干擾素α-2b治療膀胱腫瘤與其增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞人類主要組織相容性復(fù)合體的表達(dá)、使腫瘤抗原能呈遞給T細(xì)胞并激活T細(xì)胞有關(guān)。干擾素α-2b可以降低腫瘤的堿性成纖維細(xì)胞生長因子表達(dá)，減少腫瘤的新生血管形成［8］。干擾素α-2b可使Fas配體表達(dá)增加，通過Fas/FasL途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡［9］。本研究中，干擾素組大鼠膀胱腫瘤的MVD和AI均小于對照組，表明干擾素α-2b可抑制腫瘤微血管生長和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。

吡柔比星和干擾素分別從不同的機(jī)制干預(yù)大鼠膀胱腫瘤的生長，聯(lián)合應(yīng)用吡柔比星和干擾素后膀胱腫瘤生長明顯受到抑制，膀胱質(zhì)量顯著降低，并且MVD較單用干擾素組明顯降低，AI也顯著高于單一用藥組，這可能與吡柔比星和干擾素聯(lián)合應(yīng)用后起到協(xié)同作用有關(guān)。Duchek等［10］對250例膀胱癌患者分別應(yīng)用卡介苗和表柔比星+干擾素術(shù)后灌注，結(jié)果顯示卡介苗組優(yōu)于表柔比星+干擾素聯(lián)合用藥組，但干擾素能夠與其他藥物聯(lián)合應(yīng)用提高預(yù)防膀胱癌復(fù)發(fā)的療效是肯定的。另外卡介苗膀胱灌注的不良反應(yīng)也限制了其應(yīng)用。本研究對聯(lián)合應(yīng)用吡柔比星和干擾素抑制大鼠膀胱癌生長進(jìn)行了初步的觀察，并就抑制微血管生長和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡進(jìn)行了初步探討，但仍需進(jìn)一步深入研究，尤其是對機(jī)體和膀胱局部的免疫反應(yīng)進(jìn)行研究。

［1］Sylvester RJ，der Meijden AP，Oosterlinck W，et al.Predicting recurrence and progression in individual patients with stage Ta T1bladder cancer using EORTC risk tables：a combined analysis of 2596 patients from seven EORTC trials［J］.Eur Urol，2006，49 （3）：466-475.

［2］Brausi M，Collette L，Kurth K，et al.Variability in the recurrence rate at first follow-up cystoscopy after TUR in stage Ta T1transitional cell carcinoma of the bladder：a combined analysis of seven EORTC studies［J］.Eur Urol，2002，41（5）：523-531.

［3］Shah SC，Kusiak A，O′Donnell MA.Patient-recognition data-mining model for BCG-plus interferon immunotherapy bladder cancer treatment［J］.Comput Biol Med，2006，36（6）：634-655.

［4］Rosevear HM，Lightfoot AJ，Nepple KG，et al.Usefulness of the Spanish Urological Club for Oncological Treatment scoring model to predict nonmuscle invasive bladder cancer recurrence in patients treated with intravesical bacillus Calmette-Guérin plus interferon-alpha［J］.J Urol，2011，185（1）：67-71.

［5］高建國，田濤，宋亞林，等.圍手術(shù)期大劑量吡柔比星膀胱灌注預(yù)防膀胱癌復(fù)發(fā)的臨床觀察［J］.中華外科雜志，2010，48（21）：1650-1652.

［6］Qian L，Ding H，Zhou J，et al.Intravesical N-（4-hydroxyphenyl）retinamide and adriamycin induces apoptosis in bladder cancer［J］.Front Biosci，2006，11（9）：2045-2051.

［7］李清，徐濤，王曉峰.吡柔比星膀胱內(nèi)灌注預(yù)防非肌層浸潤性膀胱尿路上皮癌復(fù)發(fā)的機(jī)制［J］.中華腫瘤雜志，2009，31（12）：904-907.

［8］Yao JC，Phan A，Hoff PM，et al.Targeting vascular endothelial growth factor in advanced carcinoid tumor：a random assignment phase II study of depot octreotide with bevacizumab and pegylated interferon alpha-2b［J］.J Clin Oncol，2008，26（8）：1316-1323.

［9］Caraccio N，Cuccato S，Pratesi F，et al.Effect of type I interferon（s）on cell viability and apoptosis in primary human thyrocyte cultures［J］.Thyroid，2009，19（2）：149-155.

［10］Duchek M，Johansson R，Jahnson S，et al.Bacillus Calmette-Guérin is superior to a combination of epirubicin and interferon-alpha2b in the intravesical treatment of patients with stage T1urinary bladder cancer.A prospective，randomized，Nordic study ［J］.Eur Urol，2010，57（1）：25-31.