孫興魯 湯欣欣 朱 江 王文兵 史全良 浦冠勤

(1蘇州大學(xué)金螳螂建筑與城市環(huán)境學(xué)院，江蘇蘇州 215123; 2蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，江蘇蘇州 215123;3江蘇大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212013)

芋螺毒素(Conotoxin，CTX)是由生活在熱帶海洋中的肉食性軟體動(dòng)物芋螺(Conus)分泌的，用于麻醉獵物的小肽類毒素。它們多數(shù)是由12～46個(gè)氨基酸殘基組成，富含半胱氨酸(Cys)的動(dòng)物神經(jīng)肽毒素。芋螺毒素毒性極大，可引起動(dòng)物出現(xiàn)驚厥、顫抖、甚至麻痹死亡［1］。

目前，國(guó)內(nèi)外已明確功能的芋螺毒素只占了整個(gè)毒素庫(kù)的很小一部分，但是對(duì)它們的生理功能已經(jīng)有了較為清晰的認(rèn)識(shí)。芋螺毒素二硫鍵骨架和結(jié)構(gòu)的不同，決定了它們功能靶位的差異，已經(jīng)清楚的靶位主要包括配體門控的離子通道、電壓門控的離子通道及G蛋白偶聯(lián)的受體［2］。芋螺毒素有如下特點(diǎn):分子質(zhì)量小，結(jié)構(gòu)多樣;前導(dǎo)肽高度保守而成熟肽具有超變異性;作用靶點(diǎn)廣且具有高度組織選擇性。因而，較之其他生物來(lái)源的活性多肽具有更多的優(yōu)越性。

應(yīng)用昆蟲桿狀病毒對(duì)害蟲進(jìn)行防治，是害蟲綜合防治的一項(xiàng)重要內(nèi)容。1975年美國(guó)環(huán)?？偩峙鷾?zhǔn)了第1個(gè)用于防治棉花害蟲的美洲棉鈴蟲核型多角體病毒(Heliothis zeaNPV)殺蟲劑產(chǎn)品登記［3］。但是，野生桿狀病毒殺蟲劑具有殺蟲速度慢、寄主范圍窄、對(duì)紫外線敏感等缺點(diǎn)，限制了其作為生物防治因子的廣泛應(yīng)用［4］。為了提高其殺蟲效力，通常將野生的桿狀病毒進(jìn)行基因工程改造，包括刪除、修飾昆蟲病毒基因組內(nèi)的某些非必需基因，如缺失蛻皮激素甾體-UDP 葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因(egt)［5－7］以及插入一些對(duì)昆蟲特異性的毒素基因，調(diào)控昆蟲代謝或發(fā)育的基因以及某些酶基因等外源基因，以構(gòu)建重組病毒［8－12］。

斜紋夜蛾(Spodoptera litura)是一種多食性的重要農(nóng)業(yè)和林業(yè)害蟲，危害植物達(dá)99科290種以上［13］，在中國(guó)、日本、朝鮮、印度以及東南亞地區(qū)經(jīng)常造成嚴(yán)重危害和巨大經(jīng)濟(jì)損失［14－15］。斜紋夜蛾也是桑樹的重要鱗翅目害蟲之一。在我國(guó)，斜紋夜蛾核型多角體病毒(SpltMNPV)作為商品化殺蟲劑已推廣使用［16－17］，但仍有野生桿狀病毒殺蟲劑的諸多不足。本研究以繁殖率和毒力極強(qiáng)且基因組中不含有類芋螺毒素成熟肽基因的病毒變異株斜紋夜蛾核型多角體病毒株SpltMNPVⅡ(GenBank:NC_011616)為基礎(chǔ)，構(gòu)建缺失egt基因，同時(shí)在缺失egt基因的部位插入多角體基因啟動(dòng)子控制的類芋螺毒素成熟肽基因和p10基因啟動(dòng)子啟動(dòng)的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因(egfp)的重組載體，為構(gòu)建和篩選高效重組SpltMNPV病毒，進(jìn)一步研究與開發(fā)斜紋夜蛾生物殺蟲劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

SpltMNPVⅡ病毒株，由日本岐阜縣生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究所Katsumi Kamiya博士饋贈(zèng);斜紋夜蛾TUAT-Spli 221細(xì)胞，由日本名古屋大學(xué)資源昆蟲研究室Michihiro Kobayashi教授饋贈(zèng)。苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcMNPV)病毒株和Sf9細(xì)胞，載體質(zhì)粒pBluescript II SK(+)、轉(zhuǎn)化用宿主菌E.coliTop10，由蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院微生物學(xué)研究室保存。Spli細(xì)胞和Sf9細(xì)胞，用含10%胎牛血清(Invitrogen公司)的TC-100培養(yǎng)基(Invitrogen公司)28℃ 培養(yǎng)。pMD18-egfp，由廣東海洋大學(xué)劉艷荷博士饋贈(zèng)。Ex-Taq DNA聚合酶、限制性核酸內(nèi)切酶、載體質(zhì)粒pMD18-T載體、T4DNA連接酶等，均購(gòu)自TaKaRa公司。

1.2 病毒感染及基因組DNA的提取

實(shí)驗(yàn)使用80 cm2(Corning公司)培養(yǎng)瓶培養(yǎng)的單層貼壁細(xì)胞(1×l06cells/mL)，除去培養(yǎng)液后接種1 500μL AcMNPV或SpltMNPV病毒液，感染復(fù)數(shù)(MOI:multiplicity of infection)為1，室溫下用震蕩器慢搖1 h，使病毒吸附細(xì)胞，然后除去病毒接種液，加入13 mL TC-100培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)，28℃培養(yǎng)96 h后收取病毒感染的培養(yǎng)細(xì)胞。根據(jù)參考文獻(xiàn)［18］的方法從感染的細(xì)胞中提取病毒DNA。

1.3 類芋螺毒素基因的分子克隆

參照GenBank登錄的苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcMNPV)基因組全序列(登錄號(hào):NC_001623)ORF3(Ac-ctx)讀碼框序列，設(shè)計(jì)一對(duì)引物(表1)。以AcMNPV基因組全序列為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為94℃變性5 min，預(yù)變性后按94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min后，4℃終止反應(yīng)。DNA片段分離、連接轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒制備與純化、限制性核酸內(nèi)切酶酶切，均按參考文獻(xiàn)［19］的方法進(jìn)行，構(gòu)建的重組質(zhì)粒命名為pMD18-ctx。

表1 用于PCR擴(kuò)增的引物序列

1.4 重組轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建

根據(jù)GenBank SpltMNPVⅡ基因組全序列(NC_011616)分別設(shè)計(jì)egt上游非編碼端(egt up)，位于egt3'部分片段和egt下游非編碼端(egtdown)，多角體啟動(dòng)子(Pph)，F(xiàn)蛋白(Fusion protein)的信號(hào)肽(Signal peptide)基因引物(表1)。以上引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。DNA片段分離、連接轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒制備與純化、限制性酶切等分子克隆方法，均按參考文獻(xiàn)［20］的方法進(jìn)行。

重組轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建流程如圖1。以SpltMN-PVⅡDNA為模板，分別擴(kuò)增出同源重組臂egt上游非編碼端(egtup)、egt3＇端的部分片段和egt下游非編碼端(egtdown)。PCR程序:94℃預(yù)變性3 min;94℃變性45 s;55℃退火45 s;72℃延伸90 s，30個(gè)循環(huán);72℃再延伸10 min;4℃，10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化后分別經(jīng)KpnⅠ/XhoⅠ，NotⅠ/SacⅠ雙酶切后，依次克隆到載體pBluescriptⅡSK(+)上。鑒定為陽(yáng)性克隆且外源基因插入方向與預(yù)期一致后，命名為psk-egtup-egtdown。通過(guò)三引物PCR將多角體啟動(dòng)子基因序列與F蛋白信號(hào)肽序列連接，經(jīng)T-A連接、轉(zhuǎn)化獲得pUC-Pph-signal P;經(jīng)XhoⅠ/SmaⅠ雙酶切，將其克隆至psk-egtup-egtdown上，獲得psk-△egt-Pph-signal P;依次克隆Pp10與egfp到質(zhì)粒pBacPAK8上，命名為pBacPAK8-Pp10-egfp;經(jīng)BamHⅠ/NotⅠ雙酶切，將其克隆到psk-△egt-Pph-signal P上，命名為psk-△egt-Pph-Pp10-egfp;最后經(jīng)SmaⅠ/BamHⅠ雙酶切pMD18-ctx，將其克隆到 psk-△egt-Pph-Pp10-egfp上，最終獲得 psk-△egt-Pph-ctx-Pp10-egfp。委托上海生工生物工程技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。

圖1 重組轉(zhuǎn)移載體psk-△egt-P p h-ctx-P p10-egfp構(gòu)建策略

2 結(jié)果與分析

2.1 AcMNPV類芋螺毒素基因(Ac-ctx-like)的克隆與序列分析

2.1.1 克隆基因Ac-ctx-like的鑒定 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，在接近100 bp處可見特異性 DNA擴(kuò)增帶(圖2)。回收 Ac-ctx-like的PCR產(chǎn)物，然后與pMD18-T載體連接、轉(zhuǎn)化，提取質(zhì)粒。經(jīng)SmaⅠ和BamHⅠ雙酶切鑒定，結(jié)果與預(yù)期大小一致，表明已成功克隆Ac-ctx-like基因(圖3)?？寺』蛭猩虾Ｉど锕こ碳夹g(shù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。

圖2 Ac-ctx-like基因的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳鑒定

圖3 pMD18-ctx雙酶切的瓊脂糖凝膠電泳鑒定

2.1.2 克隆基因Ac-ctx-like的序列分析 序列分析表明，Ac-ctx-like基因?yàn)?62 bp，其中前72 bp為信號(hào)肽序列(圖4)。為了更好地進(jìn)行表達(dá)和分泌，本研究使用了斜紋夜蛾F蛋白的信號(hào)肽序列，并將該序列構(gòu)建到轉(zhuǎn)移載體上，所以克隆的Ac-ctx-like基因是從該基因的第25個(gè)氨基酸密碼子開始的90 bp片段。

圖4 Ac-ctx-like基因的DNA序和氨基酸序列

根據(jù)芋螺毒素成熟肽半胱氨酸殘基間的二硫鏈鍵橋的特征性框架排列模式和芋螺毒素前體N端區(qū)域氨基酸的高度保守的信號(hào)肽序列，芋螺毒素可以分成A、M、O、P、S、T等多個(gè)超家族。又可按照其作用靶位的不同，分為 α、μ、ω、κ、δ、φ 、σ、ρ、γ 及加壓素、驚厥劑和睡眠肽等。根據(jù)Ac-ctx-like基因推定的成熟肽半胱氨酸殘基間的二硫鏈鍵橋的特征性框架排列模式(圖5)，推測(cè)該Ac-ctx-like基因可能為類ω-芋螺毒素基因。ω-芋螺毒素是電壓敏感性鈣通道(Voltage sensitive calcium channel，VSCC)阻滯劑，屬于芋螺毒素O超家族［20］。

圖5 ω-芋螺毒素成熟肽半胱氨酸殘基間二硫鏈鍵橋的特征性框架排列模式

2.2 重組轉(zhuǎn)移載體psk-△egt-P ph-ctx-P p10-egfp的構(gòu)建與鑒定

2.2.1 Signal P+Pph基因片段的TP-PCR連接與鑒定 由于該重組轉(zhuǎn)移載體的插入片段較多，為減少載體的限制性酶切位點(diǎn)，采用三引物PCR(TP-PCR)將Signal P基因與Pph基因啟動(dòng)子序列連接，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明，連接成功(圖6)。對(duì)目的基因片段回收，經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化獲得質(zhì)粒pUC-ctx，委托上海生工生物工程技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定，測(cè)序結(jié)果與預(yù)期一致。

圖6 Signal P+P ph基因片段瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2.2 重組轉(zhuǎn)移載體 psk-△egt-Pph-ctx-Pp10-egfp構(gòu)建 重組轉(zhuǎn)移載體構(gòu)建各階段均經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶酶切鑒定，結(jié)果正確(圖7－8)。重組轉(zhuǎn)移載體psk-△egt-Pph-ctx-Pp10-egfp經(jīng)SmaⅠ /BamHⅠ雙酶切鑒定，ctx片段大小與預(yù)期一致(圖9)。經(jīng)測(cè)序證明，重組轉(zhuǎn)移載體包含了預(yù)期的各DNA片段，且克隆方向正確，無(wú)突變，上述結(jié)果證明該重組轉(zhuǎn)移載體構(gòu)建成功。

圖7 重組轉(zhuǎn)移載體egt up和egt down片段的雙酶切瓊脂糖凝膠電泳鑒定

圖8 重組轉(zhuǎn)移載體P p10+egfp片段的雙酶切瓊脂糖凝膠電泳鑒定

圖9 重組轉(zhuǎn)移載體psk-△egt-P ph-ctx-P p10-egfp的雙酶切鑒定

3 討論

SpltMNPVⅡ(SpltMNPV G10-3)是 Kamiya等從日本全國(guó)各地野外感病幼蟲收集、分離到189個(gè)SpltMNPV克隆中，篩選出的繁殖率和毒力極強(qiáng)的一種新型病毒株［21－22］。本研究是在 SpltMNPV Ⅱ基礎(chǔ)上，利用egt基因同源重組臂DNA序列，成功構(gòu)建了含有多角體基因啟動(dòng)子啟動(dòng)的類芋螺毒素基因和p10啟動(dòng)子啟動(dòng)的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(egfp)基因的重組移載體psk-△egt-Pph-ctx-Pp10-egfp。為了使外源基因獲得高效表達(dá)，在構(gòu)建重組轉(zhuǎn)移載體時(shí)，本研究使用了桿狀病毒的強(qiáng)啟動(dòng)子——SpltMNPV的多角體基因啟動(dòng)子(Pph)，并通過(guò)另一個(gè)桿狀病毒的強(qiáng)啟動(dòng)子——p10啟動(dòng)子，啟動(dòng)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白作為標(biāo)記，這樣可大大減少重組病毒的篩選與純化的工作量和時(shí)間。本研究在ctx基因前引入了AcMNPV BV膜融合蛋白GP64的同系物，SpltMNPVⅡF(Fusion)蛋白的信號(hào)肽序列，可能有利于類芋螺毒素更好地分泌表達(dá)。用構(gòu)建的重組轉(zhuǎn)移載體與SpltMNPVⅡ在斜紋夜蛾細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染，篩選重組桿狀病毒的工作正在進(jìn)行中。

現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的芋螺毒素7大超家族，能特異性地作用于體內(nèi)鉀、鈉、鈣等多種離子通道、細(xì)胞膜上的各種神經(jīng)遞質(zhì)和激肽的受體，從而干擾細(xì)胞或神經(jīng)中的信號(hào)傳遞，有很強(qiáng)的生物學(xué)活性［23］。芋螺毒素目前尚無(wú)應(yīng)用于重組桿狀病毒研究的報(bào)道，本研究首次從AcMNPV中克隆了昆蟲桿狀病毒基因組中的類芋螺毒素基因，根據(jù)克隆基因的DNA序列及其推定的氨基酸序列的結(jié)構(gòu)分析，推測(cè)該基因的表達(dá)產(chǎn)物可能類似芋螺毒素O超家族的類ω-芋螺毒素。

昆蟲桿狀病毒作為無(wú)公害生物殺蟲劑近年來(lái)備受關(guān)注，并得到廣泛應(yīng)用。重組桿狀病毒的研究已成為生物殺蟲劑研究的主要方向。本研究結(jié)果將為進(jìn)一步研制重組斜紋夜蛾核型多角體病毒生物殺蟲劑打下基礎(chǔ)。

［1］羅素蘭，張本，長(zhǎng)孫東亭.芋螺毒素［J］.生物學(xué)通報(bào)，2003，38(4):7－8.

［2］吳雪晨，彭燦.芋螺毒素國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀［J］.科技資訊，2007，(10):209－210.

［3］Inceoglu A B，Kamita SG，Hinton A C，et al.Recombinant baculoviruses for insect control［J］.Pest Management Science，2001，57:981－987.

［4］Hu Z，Vlak J M.Engineering of biosafe baculoviruses with improved insecticidal properties:development and prospects［J］.Virologica Sinica，1997，12:14 －25.

［5］Pinedo F JR，Moscardi F，Luque T，et al.Inactivation of the ecdysteroid UDP-glucosyltransferase(egt)gene ofAnticarsia gemmatalisnucleopolyhedrovirus(AgMNPV)improves its virulence towards its insect host［J］.Biological Control，2003，27:336 － 344.

［6］O'Reilly D R，Miller L K，Luckow V A.A baculovirus blocks insect molting by producing ecdysteroid UDP-glucosyl transferase［J］.Science，1989，245:1 110 －1 112.

［7］Georgievska L，Joosten N，Hoover K，et al.Effects of single and mixed infections with wild type and genetically modified Helicoverpa armigera nucleopolyhedrovirus on movement behaviour of cotton bollworm larvae［J］.Entomologia Experimentalis Et Applicata，2010，135:56 －67.

［8］Maeda S.Further development of recombinant baculovirus insecticides［J］.Current Opinion in Biotechnology，1995，6(3):313 －319.

［9］Miller L K.Genetically engineered insect virus pesticides:Present and future［J］.Invertebr Pathol，1995，65(3):211 － 216.

［10］Jinn T R，Tu W C，Lu C I，et al.Enhancing insecticidal efficacy of baculovirus by early expressing an insect neurotoxin，LqhIT2，in infected Trichoplusia ni larvae［J］.Applied microbiology and biotechnology，2006，72(6):1 247 －1 253.

［11］曹建斌，范曉軍，付月君，等.重組桿狀病毒AcMNPV-BmK IT-vcath的構(gòu)建及毒力分析［J］.山西大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2009，32(1):114 －118.

［12］Shao H，Dong D，Hu J，et al.Construction of the recombinant baculovirus AcMNPV with cathepsin B-like proteinase and its insecticidal activity against Helicoverpa armigera［J］.Pesticide Biochemistry and Physiology，2008，91(3):141 －146.

［13］梁東瑞，胡遠(yuǎn)揚(yáng)，蔡毓能，等.中國(guó)昆蟲病毒圖譜［M］.長(zhǎng)沙:湖南科學(xué)技術(shù)出版社，1986.

［14］Murata M，Etoh T，Hoyama K，et al.Sudden occurrence of the common cutworm，Spodoptera litura(Lepidoptera:Noctuidae)in southern Japan during the typhoon season［J］.Applied entomology and zoology，1998，33:419 －427.

［15］Gabriel B P.Insect and mites injurious to Philippine Crop Plants［R］.UPLB:National Crop Protection Center，1997.

［16］蘇志堅(jiān)，陳其津，李廣宏，等.斜紋夜蛾核多角體病毒與增效劑混配對(duì)斜紋夜蛾幼蟲的防治效果［J］.中國(guó)生物防治，2001，17(1):23－25.

［17］黃冠輝，丁翠.斜紋夜蛾核型多角體病毒的研究［J］.昆蟲學(xué)報(bào)，1975，18(1):17－23.

［18］Wu F，Lavina B，Iked A M，et a1.Cloning and biological characterization of Spod optera litura(Lepidoptera:Noctuidae)in nucleopolyhedrovirus isolated from China［J］.Journal of Sericultural Science of Japan，2000，69(3):177 －189.

［19］Sambrook J，F(xiàn)ritsch E，Manlatis T.Molecular Cloning:A Laboratory Manual［M］.New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989.

［20］應(yīng)士波，嚴(yán)小軍.芋螺毒素的藥用價(jià)值研發(fā)進(jìn)展［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2006，18(1):138 －143.

［21］Kamiya K，Zhu J，Murata M，et al.Cloning and comparative characterization of three distinct nucleopolyhedrovirnses isolated from the common cutworm，spodoptera litura(Lepidoptera:Noctuidae)in Japan［J］.Biological Control，2004，31(1):38 －48.

［22］朱江，沈頌東，王文兵，等.日本三株斜紋夜蛾核型多角體病毒的增殖特性及其多角體蛋白基因的序列分析［J］.昆蟲學(xué)報(bào)，2004，47(5):543 －550.

［23］王承忠，蔣輝，戚正武.芋螺毒素研究進(jìn)展［J］.生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2003，30(4):537 －543.