丁 農(nóng) 張金衛(wèi) 李江濤 魚南洋 鄒國平 馮世民 徐森華

(1湖州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江湖州 313000; 2長興縣農(nóng)業(yè)局，浙江長興 313100)

隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，家蠶生物反應(yīng)器(即家蠶－BmNPV表達(dá)系統(tǒng))成為免疫學(xué)和基因工程真核生物表達(dá)系統(tǒng)等研究領(lǐng)域的重大進展之一［1］。家蠶生物反應(yīng)器被認(rèn)為是目前最有經(jīng)濟意義的個體表達(dá)系統(tǒng)，有基因工程產(chǎn)品“微型發(fā)酵罐”之稱，在免疫學(xué)的研究和應(yīng)用中成為制備新型基因工程疫苗的優(yōu)選體系。在人以及動物的傳染病中，已有乙肝、丙肝、禽馬立克氏病、傳染性法氏囊病及口蹄疫(FMDV)等多種病毒的相關(guān)保護性抗原基因，在家蠶－BmNPV表達(dá)系統(tǒng)中得到成功表達(dá)［2－8］，重組基因工程疫苗的研制成功，在醫(yī)學(xué)和農(nóng)業(yè)科研中發(fā)揮了重要的作用，展示出誘人的應(yīng)用前景。

目前，應(yīng)用家蠶生物反應(yīng)器生產(chǎn)基因工程產(chǎn)品，主要是利用注射器對蠶蛹蛹體逐一進行人工接種，在操作過程中存在以下問題:一是蠶蛹蛹期短，很難進行規(guī)?；a(chǎn);二是用工量大、時間集中，勞動強度大、生產(chǎn)效率低;三是接種量很難控制，誤差大，造成蛹體接種后反應(yīng)不一致，既影響產(chǎn)品的質(zhì)量，又增加后續(xù)工作量。本研究是在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所和中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所研制口蹄疫基因工程疫苗的基礎(chǔ)上，利用家蠶生物反應(yīng)器進行口蹄疫疫苗抗原規(guī)?；a(chǎn)關(guān)鍵技術(shù)的研究，為家蠶生物反應(yīng)器進行規(guī)模化生產(chǎn)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

rBmNPV(P1－2A3C)重組病毒培養(yǎng)液，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所提供;口蹄疫ELISA檢測試劑盒，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所提供;秋豐×白玉蠶品種，由湖州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院提供。

1.2 蠶蛹最佳冷藏時間試驗

將秋豐×白玉飼養(yǎng)至上蔟7 d后采繭并冷藏于4～5℃中保存，每隔5 d取1批蠶繭(200粒)削繭后取出蠶蛹，按每顆蛹105pfu的劑量接種rBmNPV(P1－2A3C)重組病毒培養(yǎng)液，然后放置在25℃環(huán)境下表達(dá)4～5 d，收集發(fā)病蠶蛹血淋巴，于－20℃保存，共接種4批，以接種未經(jīng)冷藏的蠶蛹作為對照。根據(jù)口蹄疫ELISA檢測試劑盒操作步驟，檢測口蹄疫抗原組合基因(P1－2A3C)在不同冷藏時間蠶蛹中的表達(dá)效率。具體操作步驟:96孔酶標(biāo)板用兔抗FMDV陽性血清包被，4℃過夜;用脫脂奶粉封閉后，將所收集的蠶蛹血淋巴做2倍梯度稀釋，37℃作用1 h;用PBS洗滌后加入豚鼠抗FMDV陽性血清，37℃作用1 h;用PBS洗滌后加入HRP－兔抗豚鼠IgG，37℃作用1 h;加入底物OPD－H2O2，于37℃作用15 min，用終止液結(jié)束反應(yīng)，于492 nm處測定A值，即OD492nm值，該值越大表明表達(dá)的外源蛋白量越大。

1.3 目的蛋白在規(guī)?；a(chǎn)中的表達(dá)時相的測定

將秋豐×白玉飼養(yǎng)至上蔟7 d后采繭、削繭，取100 kg蠶蛹接種rBmNPV(P1－2A3C)重組病毒培養(yǎng)液，接種后從48 h開始，每隔12 h收集發(fā)病蠶蛹，用口蹄疫ELISA檢測試劑盒測定口蹄疫抗原組合基因(P1－2A3C)在蠶蛹中的表達(dá)時相。

1.4 蠶蛹集團注射機的研制及與手工注射的比較試驗

在利用家蠶生物反應(yīng)器生產(chǎn)基因工程產(chǎn)品的過程中，對蠶蛹蛹體的接種一般都是由人工逐一進行接種的，但是由于接種人員的熟練程度、疲勞程度等原因易導(dǎo)致接種量很難控制，人為誤差較大，并且用工比較集中。為了解決這一問題，我們根據(jù)蠶蛹接種的一系列步驟(注射器消毒、清洗、加液、接種)與特點，試制了家蠶蠶蛹集團注射機。并檢驗了蠶蛹集團注射機的生產(chǎn)效率，方法是取100 kg蠶蛹接種rBmNPV(P1－2A3C)重組病毒培養(yǎng)液，用蠶蛹集團注射機和人工分別接種50 kg蠶蛹，從注射量精確度、注射速度、注射后蠶蛹的死亡率及目的蛋白的表達(dá)量進行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 蠶蛹最佳冷藏時間試驗

利用口蹄疫ELISA檢測試劑盒檢測口蹄疫抗原組合基因(P1－2A3C)在不同冷藏時間蠶蛹中的表達(dá)效率，結(jié)果顯示將蠶蛹冷藏于4℃后，5 d與10 d時的基因表達(dá)效率與未經(jīng)冷藏處理蠶蛹的表達(dá)效率非常接近，能夠滿足規(guī)模化生產(chǎn)的需求;而15、20 d時的表達(dá)效率雖然也相近，但卻遠(yuǎn)低于未經(jīng)冷藏處理蠶蛹的表達(dá)效率，不能滿足規(guī)模化生產(chǎn)的要求(表1)。從本次試驗結(jié)果可知，將蠶蛹保藏于4℃10 d內(nèi)接種不會影響目的蛋白在蠶蛹中的表達(dá)效率，在規(guī)模化生產(chǎn)中可以利用冷藏來延長蠶蛹的接種期限，加大產(chǎn)品的生產(chǎn)量。

表1 口蹄疫抗原組合基因(P1－2A3C)在不同冷藏時間蠶蛹中的表達(dá)效率(OD492 nm)

2.2 目的蛋白在規(guī)?；a(chǎn)中的表達(dá)時相的測定

為了確定目的蛋白的最佳收集時間，對蠶蛹接種rBmNPV(P1－2A3C)重組病毒培養(yǎng)液后，從48 h開始，每隔12 h隨機收集200頭發(fā)病蠶蛹的血淋巴，于－20℃下保存。利用口蹄疫ELISA檢測試劑盒檢測血淋巴中目的蛋白的表達(dá)量，結(jié)果是在48 h時就檢測到了目的蛋白的表達(dá)，且隨著感染時間的延長而迅速增加，108 h后保持穩(wěn)定狀態(tài)。因此，在蠶蛹接種后108～120 h收集蠶蛹的血淋巴，均可獲得很高的蛋白表達(dá)量。從而可知，蠶蛹在108 h時目的蛋白的表達(dá)量達(dá)到最高量并保持穩(wěn)定狀態(tài)(表2)。

表2 口蹄疫抗原組合基因(P1－2A3C)在蠶蛹中不同時間的表達(dá)效率

2.3 蠶蛹集團注射機的研制及與手工注射的比較試驗

根據(jù)家蠶蠶蛹接種的一系列步驟特點，我們研制了家蠶蠶蛹集團注射機(圖1)，該機器是一種半自動化的機械注射裝置，具有高效、安全、注射量準(zhǔn)確、結(jié)構(gòu)簡單及使用方便的特點。該機器已獲國家發(fā)明和實用新型專利(專利號分別為:ZL 2009 1 0095597.1、ZL 2009 2 0113230.3)。

圖1 蠶蛹集團注射機整體結(jié)構(gòu)示意圖

家蠶蠶蛹集團注射機研制成功后，我們進行了用蠶蛹集團注射機注射蠶蛹與手工注射蠶蛹的比較試驗，從試驗結(jié)果看(表3)，機器注射的工作效率是手工注射的4.26倍，注射后蠶蛹的死亡率、目的蛋白的表達(dá)量相近。值得注意的是，手工注射的速度與操作人員的熟練度、疲勞度等因素有關(guān)。由于機器注射和手工注射使用的是同一型號的注射器，故精確度是一樣的，但在實際操作中，人工注射由于不同操作人員的熟練度不一樣而導(dǎo)致注入蠶蛹的病毒量會出現(xiàn)誤差，而機器注射則避免了這一誤差。

表3 蠶蛹集團注射機注射蠶蛹與手工注射蠶蛹的效果比較

3 小結(jié)與討論

家蠶飼養(yǎng)歷史悠久，遺傳背景清楚，利用家蠶生物反應(yīng)器生產(chǎn)有用蛋白比其他表達(dá)系統(tǒng)更具優(yōu)勢。目前，已有多種蛋白得到了高效表達(dá)，部分蛋白生產(chǎn)已取得了轉(zhuǎn)基因生物安全生產(chǎn)證書，可以進行大規(guī)模的面上生產(chǎn)。在家蠶生物反應(yīng)器生產(chǎn)的目的蛋白中，多數(shù)是利用家蠶幼蟲進行表達(dá)目的蛋白，雖然家蠶幼蟲能獲得高效的目的蛋白表達(dá)，但由于幼蟲期比較活潑，逐一接種難度比較大，且收獲目的蛋白時較為麻煩。我們研究發(fā)現(xiàn)利用家蠶蠶蛹進行目的蛋白表達(dá)可以獲得同樣的效果，并且更容易收獲目的蛋白，這為規(guī)?；眉倚Q生物反應(yīng)器生產(chǎn)有用蛋白奠定了基礎(chǔ)。

本研究主要是在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所和中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所研制的口蹄疫基因工程疫苗的基礎(chǔ)上，研究利用蠶蛹進行規(guī)?；a(chǎn)的關(guān)鍵技術(shù)，根據(jù)口蹄疫抗原組合基因(P1－2A3C)在不同冷藏時間的蠶蛹中的表達(dá)效率可知，通過低溫(4℃)冷藏蠶蛹，可以延長10 d的生產(chǎn)時間，并且其蛋白的表達(dá)效率幾乎不受影響，從而可以加大產(chǎn)品的生產(chǎn)量。值得注意的是，在應(yīng)用蠶蛹進行生產(chǎn)其他基因工程產(chǎn)品時，隨著表達(dá)的目的蛋白的不同，蠶蛹的冷藏時間會有所不同，實際生產(chǎn)中應(yīng)根據(jù)表達(dá)不同的目的蛋白進行蠶蛹冷藏時間實驗，確定所要生產(chǎn)蛋白的蠶蛹的最佳冷藏時間。

在生產(chǎn)中所表達(dá)的目的蛋白的收獲時間是非常重要的，收獲時間過早很難獲得高效表達(dá)，收獲時間過晚會影響蛋白的穩(wěn)定性，從目的蛋白在規(guī)?；a(chǎn)中的表達(dá)時相來看，在規(guī)?；a(chǎn)中，蠶蛹接種后108～120 h收集蠶蛹的血淋巴，可獲得最高的蛋白表達(dá)量。

在生產(chǎn)中需要對蠶蛹逐一接種，這在一定程度上阻礙了目的蛋白的生產(chǎn)，本研究中所發(fā)明的蠶蛹集團注射機很好地解決了這一問題，該機器使注射器的消毒、清洗、加藥、蠶蛹接種在機械上逐一完成，明顯提高了產(chǎn)品質(zhì)量，工作效率是手工注射的4～5倍，注射后蠶蛹的死亡率和目的蛋白的表達(dá)量與手工注射相近，減輕了勞動強度，降低了生產(chǎn)成本，并且其結(jié)構(gòu)簡單、使用方便，便于利用蠶蛹作為生物反應(yīng)器大規(guī)模生產(chǎn)基因工程產(chǎn)品。

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