王春來 李晶晶

全反式維甲酸［1，2］是維生素A相關(guān)藥物，在臨床上已成功用于治療白血病，具有抑制細胞增生及誘導(dǎo)分化作用。最近其對腎臟病的治療尤其是抑制炎細胞浸潤及肌成纖維細胞增生方面，開始受到重視。腎小管間質(zhì)損害程度與腎小球濾過率成負相關(guān)，且比腎小球病變更能預(yù)測預(yù)后［3，4］，腎小管間質(zhì)纖維化是多種慢性腎臟疾病發(fā)展至終末期腎衰的共同途徑。本文旨在探討維甲酸對UUO模型大鼠腎間質(zhì)纖維化的作用。

1.材料與方法

1.1 動物模型及分組 成年雄性Sprague-Dawley大鼠30只，體重(250～300)g(由遼寧醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供)。隨機分為3組:正常對照組(假手術(shù)組)10只;模型組(UUO組)10只;給藥組(all-trans-retinoic acid治療組)10只。模型組及給藥組行左側(cè)輸尿管結(jié)扎術(shù):3.8%的水合氯醛1mg/kg腹腔麻醉，常規(guī)碘酒酒精消毒，腹正中切口進入腹腔，暴露左腎，沿左腎下極尋找到左輸尿管并游離，在離左腎下極0.3cm處用絲線上下結(jié)扎兩處輸尿管，然后從中剪斷以防逆行性感染，逐層縫合。假手術(shù)組只游離但不結(jié)扎和剪斷輸尿管，其他手術(shù)過程同另兩組;給藥組行左側(cè)輸尿管結(jié)扎術(shù)后，每天予維甲酸(10mg/kg)灌胃，前兩組每天給予等量生理鹽水灌胃。每組大鼠飼養(yǎng)至9天后，處死，取梗阻側(cè)腎，分別固定于福爾馬林溶液中。

1.2 實驗試劑 維甲酸all-trans-retinoic acid(重慶華邦制藥股份有限公司);兔抗人結(jié)締組織生長因子多克隆抗體(武漢博士德有限公司);小鼠抗大鼠α-平滑肌肌動蛋白抗體(美國抗體診斷公司);sp工作液試劑盒(北京中山公司)

1.3 檢測指標(biāo)和方法

1.3.1 組織學(xué)檢查 腎組織經(jīng)固定、脫水、石蠟包埋，切片厚2μm，經(jīng)蘇木素-伊紅(HE)染色及馬松三色染色(Masson)染色，觀察腎小管間質(zhì)病變，由兩個觀察者對每個樣本腎組織的HE染色及Masson染色進行盲法評分，取兩觀察者評分的平均值。對腎小管間質(zhì)損害程度采用百分比評分法進行評估，每張標(biāo)本低倍鏡下(100×)依序單盲觀察左上、右上、左下、右下、中間5個腎小管間質(zhì)視野，根據(jù)腎小管上皮細胞空泡變性，腎小管擴張，腎小管萎縮，間質(zhì)水腫、間質(zhì)纖維化等表現(xiàn)的范圍進行評分。無變化為0分，范圍＜25%為1分，25% ～50%為2分，范圍＞50%為3分。分別計算評分，然后計算平均值，作為該標(biāo)本的腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)。腎間質(zhì)浸潤的炎細胞數(shù)，按文獻描述的方法［5］，400倍光鏡下，每張切片隨機選擇10個不含腎小球的視野，計算腎間質(zhì)內(nèi)炎細胞(單核巨噬細胞、淋巴細胞、中性粒細胞)結(jié)果以(炎細胞/HP×400表示)。

1.3.2 免疫組織化學(xué) 4μm的石蠟切片常規(guī)脫蠟入水，新鮮配制的3%的過氧化氫10分鐘，CTGF微波修復(fù)抗原，以蛋白阻斷液阻斷20分鐘，CTGF滴加兔抗人CTGF多克隆抗體(1∶200)，α-SMA滴加小鼠抗大鼠α-SMA抗體，4℃孵育過夜，然后加入生物素化第二抗體，室溫20分鐘，再加鏈霉素-生物素-辣根過氧化物酶復(fù)合物工作液，室溫20分鐘，最后用DAB顯色，顯微鏡下控制顯色時間，最后以蘇木素復(fù)染、脫水、透明、封片，實驗同時以PBS替代一抗做陰性對照。取各組標(biāo)本的免疫組化切片，用計算機圖象分析軟件(CMIAS系列多功能真彩色病理圖像分析系統(tǒng))對所選視野內(nèi)的免疫組化陽性信號進行計算機讀片，以陽性染色區(qū)域的積分光密度值做半定量分析測定值。

2.結(jié)果

2.1 維甲酸對腎間質(zhì)病理損害的影響 UUO模型第9天，腎小管擴張、腎小管上皮細胞變性和脫落、腎間質(zhì)增寬，伴單個核白細胞浸潤，甚至出現(xiàn)較嚴重的腎小管損害和腎間質(zhì)纖維化，腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)評分分值顯著高于假手術(shù)組(P＜0.01)，維甲酸治療組腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)評分分值顯著低于對照組(P＜0.01)，見表1。

表1 各組腎間質(zhì)損傷指數(shù)評分

2.2 維甲酸對腎間質(zhì)炎細胞浸潤的影響 假手術(shù)組僅偶見個別炎性細胞。UUO模型組炎細胞(巨噬細胞)浸潤逐漸增多，浸潤的巨噬細胞主要集中在腎小管間質(zhì)損害顯著處，維甲酸顯著抑制腎間質(zhì)炎細胞浸潤，炎細胞數(shù)(巨噬細胞)顯著低于對照組(P＜0.01)，見表2。

表2 各組腎間質(zhì)炎細胞數(shù)(炎細胞/HP×400表示)

2.3 維甲酸對腎間質(zhì)α-SMA表達的影響 α-SMA是平滑肌和肌成纖維細胞的標(biāo)記蛋白。UUO模型組α-SMA陽性染色區(qū)域主要集中在腎小管間質(zhì)病理損害嚴重處，個別腎小管上皮細胞表達α-SMA，但腎小球未見有α-SMA細胞。維甲酸治療組間質(zhì)α-SMA陽性染色區(qū)域與對照組比較差異有顯著性(P＜0.01)，腎間質(zhì)總α-SMA陽性染色區(qū)域與腎小管間質(zhì)損害程度呈顯著正相關(guān)(r＜0.931)，提示肌成纖維細胞在腎間質(zhì)纖維化中起重要作用，見表3。

2.4 維甲酸對腎間質(zhì)CTGF表達的影響 CTGF在假手術(shù)組腎間質(zhì)區(qū)無或僅有微量表達，在模型組腎間質(zhì)可見較多的散在的片狀分布，以髓質(zhì)區(qū)最明顯，而腎小球未見陽性表達，而治療組明顯減輕(P＜0.01)。免疫組化半定量分析，見表3。

表3 維甲酸治療對腎間質(zhì)α－SMA、CTGF的影響

3.討論

UUO模型是目前廣泛用于研究腎間質(zhì)纖維化比較成熟的動物模型，它所致的腎間質(zhì)纖維化，與尿路壓力升高、缺血、缺氧、炎細胞浸潤、氧化應(yīng)激、細胞因子和生長因子表達增加等因素有關(guān)［6］，具有無高血壓、無蛋白尿、無血脂異常及無免疫和毒性損害等特點。本研究發(fā)現(xiàn)UUO術(shù)后9天，小管間質(zhì)纖維組織增生、炎細胞浸潤及細胞增殖明顯，部分小管不同程度萎縮、管腔閉塞或擴張、壞死，小管間質(zhì)區(qū)面積擴大，小管細胞基底膜不同程度斷裂增厚;與國內(nèi)外文獻報道一致［7］，以上結(jié)果表明該動物模型的建立是成功的。

腎間質(zhì)纖維化是所有慢性腎臟疾病進行性發(fā)展的共同最終通路，因此如何防止和控制腎間質(zhì)纖維化對延緩慢性進行性腎臟疾病的發(fā)展至關(guān)重要。

維甲酸是維生素A活性代謝產(chǎn)物，它通過與維甲酸受體RAR-α，β，γ和 BXR-α，β，γ結(jié)合，調(diào)節(jié)細胞增生、分化和影響胚胎發(fā)育，對多種細胞如平滑肌細胞和腫瘤細胞增生有抑制作用［8，9］，還具有抗炎和調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)合成等作用。本研究顯示在防治腎間質(zhì)纖維化方面，全反式維甲酸具有減輕UUO大鼠腎小管間質(zhì)病理改變的作用，病理結(jié)果顯示全反式維甲酸組腎小管損傷和間質(zhì)纖維化程度較UUO組明顯減輕，小管間質(zhì)病理損傷評分P＜0.05。

本研究顯示維甲酸可以明顯減輕腎間質(zhì)炎細胞浸潤，與對照組相比炎細胞明顯減少(P＜0.01)。T淋巴細胞及單核/巨噬細胞［10］為多數(shù)情況下腎小管間質(zhì)病變中的主要浸潤細胞，可通過釋放淋巴因子、炎癥介質(zhì)、上調(diào)趨化因子或黏附分子的表達促進腎臟固有細胞或其自身的活化。外周血中的單核細胞在各種單核細胞趨化因子(MCP-1、RANTES)的趨化作用下可浸潤腎間質(zhì)，活化并增殖為大量的巨噬細胞。最近的動物實驗研究中，人們注意到單核巨噬細胞浸潤與腎間質(zhì)纖維化同步。

以往的組織病理技術(shù)很難區(qū)別浸潤的細胞類型，現(xiàn)在的實驗技術(shù)發(fā)展使人們得以進一步認清浸潤細胞的種類，除炎癥細胞外，還有肌成纖維細胞。α-SMA是平滑肌細胞和肌成纖維的標(biāo)記蛋白，而肌成纖維細胞在纖維化過程中發(fā)揮重要作用。本研究采用免疫組化方法觀察腎間質(zhì)中α-SMA表達以明確肌成纖維細胞的增殖情況。肌成纖維細胞積聚產(chǎn)生過多的ECM，可導(dǎo)致腎小球濾過面積下降，最終導(dǎo)致腎功能衰竭。維甲酸治療顯著抑制腎間質(zhì)α-SMA，提示維甲酸能減少腎間質(zhì)成纖維積聚和細胞外基質(zhì)合成，從而減輕腎間質(zhì)纖維化。

維甲酸抑制肌成纖維細胞積聚的機制如何?本研究通過免疫組化的方法檢測了CTGF。CTGF是TGF-β1的下游因子，而TGF-β1致纖維化已得到證實。CTGF是TGF-β1活性的調(diào)節(jié)者，CTGF抗體或反義寡核苷酸可減少TGF-β1刺激成纖維細胞和腎小球系膜細胞產(chǎn)生細胞外基質(zhì)。維甲酸治療顯著抑制腎臟CTGF表達，因此維甲酸可能通過下調(diào)腎臟TGF-β1、CTGF表達而抑制腎間質(zhì)肌成纖維細胞增生。

維甲酸能夠減輕UUO模型腎小管間質(zhì)損傷，減少炎細胞浸潤，抑制α-SMA、CTGF表達，減輕腎間質(zhì)纖維化，可望成為治療腎間質(zhì)纖維化的有前途藥物。

1 王智，馮金萍，郝淼旺，等.11例急性早幼粒細胞白血病患者并發(fā)維甲酸綜合征的臨床分析［J］.中國實驗血液學(xué)雜志，2003，11(05):14-18.

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3 王海燕.重視和研究小管-間質(zhì)損害在腎小球疾病發(fā)展和預(yù)后中的作用［J］.中華腎臟病雜志，2000，16(01):5-6.

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5 田少江，賈汝漢，丁國華，等.阿托伐他汀對腎間質(zhì)纖維化大鼠間質(zhì)巨噬細胞增殖的影響［J］.中國醫(yī)師雜志，2003，(04):65-67.

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