王 廣， 王曉鈺， 李 艷， 王麗京， 雷 健， 張笑壇， 耿建國， 楊雪松△

(1暨南大學(xué)香港大學(xué)腦功能與健康聯(lián)合實驗室，暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院組織與胚胎學(xué)系，廣東廣州510632;2廣東藥學(xué)院血管生物學(xué)實驗室，廣東廣州510224)

在胚胎發(fā)育的原腸胚后期，神經(jīng)褶(neural fold)的兩側(cè)相互靠攏，形成一個管道，稱之為神經(jīng)管(neural tube)，神經(jīng)管逐漸發(fā)育為脊椎動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)，因此神經(jīng)管是神經(jīng)系統(tǒng)正常形成的基礎(chǔ)。體節(jié)是位于脊索和神經(jīng)管兩側(cè)分節(jié)排列的中胚層組織團塊組織，是一種發(fā)育過程中的暫時性結(jié)構(gòu)，是骨骼、肌肉、皮膚和尿殖器官(泌尿、生殖器官)的發(fā)生來源。神經(jīng)管上基因表達與體節(jié)發(fā)育是緊密相關(guān)的，例如神經(jīng)管表達的Wnt1能夠促進noggin基因的表達，noggin基因不僅對體節(jié)發(fā)育有重要作用，還是形成神經(jīng)管背側(cè)細胞的BMP(bone morphogenetic protein)基因的拮抗基因[1]。

Slit/Robo(roundabout)信號最早報道是在果蠅體內(nèi)具有神經(jīng)軸突導(dǎo)向作用[2]。Slit是一類富含亮氨酸重復(fù)序列(LRRs)及多個EGF樣重復(fù)序列組成的分泌性蛋白，主要在神經(jīng)系統(tǒng)中表達。Slit受體Robo蛋白家族在雞胚早期神經(jīng)管的表達已有報道，研究表明體節(jié)期Robo2能夠表達在脊索、神經(jīng)管、體節(jié)和血島部位[3]，而Robo4明確的表達在血管內(nèi)皮，因此Slit家族及其受體Robo家族的表達還是有一定差異性的。在胚胎發(fā)育早期，神經(jīng)管與體節(jié)之間有一群神經(jīng)嵴細胞，隨著胚胎的發(fā)育將會遷移至體節(jié)，已有文獻報道Slit2和Robo1都能在神經(jīng)嵴細胞中表達，對于神經(jīng)嵴細胞腹側(cè)的遷移途徑有一定抑制作用[4]。由于神經(jīng)管發(fā)育對神經(jīng)嵴細胞遷移及體節(jié)發(fā)育都有重要影響，因此我們選取神經(jīng)管尚未完全閉合和體節(jié)剛剛開始分化的HH10[5]雞胚發(fā)育時期，采用在活體胚胎細胞電穿孔的方法轉(zhuǎn)染基因在胚胎神經(jīng)管的單側(cè)，另一側(cè)為正常對照側(cè)，探討Slit2/Robo1信號對神經(jīng)管及體節(jié)發(fā)育的影響。

材料和方法

1 材料

胚蛋(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)新鮮正大肉雞發(fā)展中心);Robo1－shRNA－GFP和pEGFP－N1(耿建國實驗室提供);Slug(Kees Weijer實驗室提供);anti－GFP(Novus);anti－rabbit Alexa Fluor 488(Invtrogen);anti－ mouse Alexa Fluor IgM555(Invtrogen);anti－HNK－1(Sigma);DIG RNA labeling kit(Roche);anti－digoxigenin－AP Fab fragments(Roche);DH5α大腸桿菌感受態(tài)(TaKaRa);質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖?北京天根生化科技有限公司);DNA回收純化試劑盒(北京天根生化科技有限公司);明膠(北京奇華盛生物技術(shù)有限公司);Milli－Q Integral水純化系統(tǒng)(Millipore);ECM309 Electroporation System(BTX);MVX10體視熒光倒置顯微鏡(Olympus);數(shù)顯電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠);CM1900型冷凍切片機(Leica)。

2 方法

2.1 蛋內(nèi)轉(zhuǎn)染 37℃溫箱孵育36 h后，HH10胚蛋橫放，70%乙醇擦拭蛋殼消毒，在氣室對側(cè)用注射器抽出4 mL蛋清，透明膠帶封口。在胚蛋側(cè)面剪刀剪開1個小窗，體式顯微鏡下將質(zhì)粒注射入神經(jīng)管腔內(nèi)，此時神經(jīng)管尚未完全閉合，見圖1。轉(zhuǎn)染完畢后潔凈透明膠帶封口，37℃溫箱孵育10 h，取出雞胚[6]，4%多聚甲醛固定4℃過夜。實驗重復(fù)3次。

Figure 1.The methods of in ovo electroporation at HH10 in chick embryo.A:an egg was windowed on the lateral at HH10.B:plasmid DNA was injected into the lumen of the neural tube from dorsal side of chick embryo using microinjection.The electrodes were laid aside parallel with embryonic craniocaudal axis.C，D:carmine staining，D is the section of neural tube at the dotted line－indicated site of the whole embryo.圖1 雞胚HH10期蛋內(nèi)電穿孔轉(zhuǎn)染方法

2.2 原位雜交 4%多聚甲醛固定的胚胎梯度濃度過甲醇/PTW后，100%甲醇洗2次，隨后梯度洗入PTW。65℃預(yù)雜交1 h，80℃預(yù)熱5 min的探針65℃孵育過夜，含有2%Boehringer和20%滅活羊血清的TBST封閉液室溫封閉2 h，1∶1 000 anti－DIG 4℃搖床過夜，堿性磷酸酶顯色。

2.3 免疫熒光 原位雜交后的胚胎PTW洗3次，含有10%滅活羊血清的PBT室溫封閉2 h，Ⅰ抗(anti－GFP:1∶1 000;anti－HNK －1:1∶500)4 ℃搖床過夜，1∶1 000熒光Ⅱ抗顯色(anti－rabbit Alexa Fluor 488，anti－mouse Alexa Fluor IgM555)。

2.4 冰凍切片 胚胎采用明膠 －蔗糖包埋[7]，切片厚度20 μm。

結(jié) 果

1 Robo1－shRNA－GFP能夠下調(diào)神經(jīng)管Robo1的表達

Robo1在雞胚早期神經(jīng)管、體節(jié)、脊索等處都有表達。pEGFP－N1正常對照組神經(jīng)管轉(zhuǎn)染側(cè)與對照側(cè)Robo1的表達無差異，見圖2A－C;Robo1－shRNA－GFP組轉(zhuǎn)染側(cè)的Robo1表達較對照側(cè)有降低效果，見圖2D－F，提示實驗中使用在體轉(zhuǎn)染Robo1－shRNA－GFP的方法能夠使神經(jīng)管Robo1的表達降低，干擾Slit2/Robo1信號通路。

Figure 2.Down－regulation of Robo1 expression in neural tube of chick embryo using Robo1－shRNA －GFP.A，C and D，F(xiàn):pEGFP－N1 and Robo1－shRNA －GFP were transfected in left side of neural tube，respectively.B，C，E，F(xiàn):the expression of Robo1 in chick embryos were checked using RNA －RNA in situ hybridization.B，C:the expression of Robo1 between the electroporation side and control side of neural tube was similar in pEGFP－N1 control group.E，F(xiàn):Robo1－shRNA－GFP down－regulated the expression of Robo1 in neural tube as indicated by red arrows.Scale bar=50 μm.NT:neural tube;So:somite;No:notochord.圖2 Robo1－shRNA－GFP下調(diào)雞胚早期神經(jīng)管Robo1的表達

2 下調(diào)Robo1在神經(jīng)管的表達導(dǎo)致神經(jīng)管發(fā)育異常

在胚胎HH10時期，神經(jīng)管尚未完全閉合(圖1D)。轉(zhuǎn)染pEGFP－N1后，神經(jīng)管發(fā)育正常(圖3A－C)，而Robo1－shRNA－GFP組胚胎的神經(jīng)管發(fā)育異常(圖3D－F)，以脊索至神經(jīng)管閉合處為中線位置，轉(zhuǎn)染側(cè)神經(jīng)管較正常側(cè)短小(圖3F)。

Figure 3.Blocking Slit2/Robo1 signaling via down－regulation of Robo1 resulted in abnormal fusion of neural tube and expression of Slug.A －C:transfection of GFP had no effect on the fusion of neural tube(labeled by dotted lines in C)and expression of Slug(indicated by red arrows in B).D－F:both fusion of neural tube(labeled by dotted lines in F)and expression of Slug pattern(indicated by a green arrow in E)were impeded by down － regulated Robo1 expression.Scale bar=20 μm.NT:neural tube;No:notochord.圖3 雞胚早期下調(diào)Robo1對神經(jīng)管閉合與Slug表達的影響

已有文獻報道，Slug的表達受到抑制，神經(jīng)管的閉合也會受到抑制[8]，于是我們進一步檢測Sliy的表達。圖3顯示，pEGFP－N1組Slug表達正常，而Robo1－shRNA－GFP組轉(zhuǎn)染側(cè)神經(jīng)管閉合處的Slug未像pEGFP－N1組一樣對稱表達，該時期轉(zhuǎn)染側(cè)神經(jīng)管已經(jīng)不表達Slug了。

3 下調(diào)Robo1后神經(jīng)嵴細胞遷移異常導(dǎo)致體節(jié)提前分化

HNK－1能夠用于標(biāo)記正在遷移的神經(jīng)嵴細胞，在大鼠的胚胎發(fā)育中還可以用來標(biāo)記生骨節(jié)和生肌節(jié)來源的細胞亞群[9]。因為神經(jīng)嵴細胞能夠遷移至體節(jié)，神經(jīng)嵴細胞的遷移路線與體節(jié)的發(fā)育也有著密切關(guān)系[10]。從圖4看出正常對照組(pEGFPN1)神經(jīng)嵴細胞遷移正常，在胚胎的近尾端體節(jié)處雙側(cè)的神經(jīng)嵴細胞同時遷出較少(圖4C);而Robo1－shRNA－GFP組神經(jīng)管的閉合、Slug的表達以及神經(jīng)嵴細胞遷移都受到了影響，Robo1下調(diào)側(cè)的神經(jīng)嵴細胞較對照側(cè)遷出明顯增多(圖4G)，進入體節(jié)的生皮肌節(jié)。由于神經(jīng)嵴細胞的提前遷移，促進了體節(jié)的發(fā)育。

Figure 4.The migration of neural crest cells to somites was enhanced after down－regulation of Robo1 in neural tube.B:Slug expression was similar between transfection side and control side in pEGFP－N1 control group.C，D:the migration of neural crest cells to somites was similar between transfection side and control side in pEGFP－N1 control group(red arrows).F:both fusion of neural tube and expression of Slug pattern were impeded by down－regulated Robo1 expression.G，H:the neural crest cells on the transfection side migrated to somites earlier than those on the control side in Robo1－shRNA－GFP group(green arrows).Scale bar=20 μm.圖4 下調(diào)Robo1表達增加神經(jīng)嵴細胞遷移至體節(jié)

討 論

Slit蛋白及其受體Robo蛋白在進化上都屬于比較保守的家族，在哺乳動物中至少含有3個Slit基因(Slit1，Slit2，Slit3)和4個Robo基因(Robo1，Robo2，Robo3，Robo4)，Slit2及其受體Robo1在神經(jīng)管以及以后的整個中樞神經(jīng)系統(tǒng)都有表達[11，12]，在胚胎發(fā)育過程中由于神經(jīng)管不閉合而導(dǎo)致的畸形我們稱之為神經(jīng)管缺陷(neural tube defects，NTDs)，全球新生兒發(fā)病率高達 1/1 000－1/100[13]，常見的 NTDs包括無腦畸形、腦膨出、露腦、顱脊柱裂、脂肪瘤型脊髓脊膜膨出、腦膜膨出、脊髓脊膜突出等[14]。本實驗選取HH10期胚胎為實驗?zāi)Ｐ?，神?jīng)管尚未完全閉合，在實驗中干擾了半側(cè)神經(jīng)管Robo1的表達后，下調(diào)Robo1側(cè)的神經(jīng)管較正常側(cè)發(fā)育得短小，并且Slug的表達也受到了明顯干擾，提示Slit2/Robo1能夠影響Slug的表達，進而在胚胎發(fā)育早期影響神經(jīng)管的閉合。

神經(jīng)嵴細胞的正常產(chǎn)生和遷移對多種組織的發(fā)育具有重要意義。常見的神經(jīng)嵴細胞遷移異常而導(dǎo)致的疾病包括Waardenburg綜合癥和DiGeorge綜合癥等[15，16]。由于遷移的神經(jīng)嵴細胞將會分布到機體的各個部位，從最早發(fā)生的器官心臟到神經(jīng)系統(tǒng)、腺體、骨骼、牙齒、眼睛等，有些學(xué)者甚至提出神經(jīng)嵴細胞是第四胚層的建議[17]。在雞胚發(fā)育過程中，神經(jīng)嵴細胞的遷移大體有背側(cè)和腹側(cè)2條路線[18]。Slug作為轉(zhuǎn)錄因子能夠通過促進上皮－間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程產(chǎn)生神經(jīng)嵴細胞[19]。本實驗發(fā)現(xiàn)下調(diào)Robo1側(cè)的神經(jīng)嵴細胞提前遷向了體節(jié)的生皮肌節(jié)，而且Slug的表達也發(fā)生了異常，提示Slit2/Robo1對神經(jīng)嵴細胞的產(chǎn)生或者遷移方向有影響作用，可能是通過Slug基因的表達來進行調(diào)節(jié)的。

體節(jié)是脊椎動物胚胎發(fā)育過程中一個暫時性結(jié)構(gòu)，是脊椎動物發(fā)育分節(jié)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)[20]，隨著胚胎的發(fā)育繼續(xù)形成生骨節(jié)和生皮肌節(jié)。至少2種人類疾病－脊椎肋骨發(fā)育不全和Alagille綜合癥是與體節(jié)發(fā)育異常相關(guān)的[21]。Robo1在雞胚發(fā)育至2.5 d時也會表達在體節(jié)生皮肌節(jié)[4];神經(jīng)管、脊索、外胚層和神經(jīng)嵴細胞都會影響體節(jié)生皮肌節(jié)的形成和分化[22]。本實驗發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)嵴細胞的異常遷移導(dǎo)致了體節(jié)的提前分化，提示Slit2/Robo1在體節(jié)分化中有重要作用。尚不清楚的是這種作用是直接的還是間接的，機制如何，有待進一步探討。

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