周 榮， 姚 巍， 李彥紅， 王鳳芝

(山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院心內(nèi)科，山西太原030001)

誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)分化為心肌細(xì)胞一直是干細(xì)胞移植治療心臟病的研究熱點(diǎn)[1]。然而，由于這類細(xì)胞魚目混珠，其中能真正發(fā)揮治療作用的干細(xì)胞數(shù)量較少且多變，使植入細(xì)胞存活數(shù)量少，分化率低，致其對(duì)心肌梗死和心衰患者的遠(yuǎn)期療效受到很大限制。環(huán)磷酸腺苷(3'，5'-cyclic adenosine monophosphate，cAMP)作為第二信使在體內(nèi)發(fā)揮重要的生理作用。研究表明cAMP參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖與分化，但其作用因細(xì)胞類型不同而各異。環(huán)磷酸腺苷葡甲胺(meglumine cyclic adenylate，MCA)是環(huán)磷酸腺苷類似物，在臨床上主要用于心力衰竭的治療。本研究將MCA加入細(xì)胞培養(yǎng)液中干預(yù)BMSCs的培養(yǎng)，探討其對(duì)細(xì)胞活性和心肌特異性基因表達(dá)的影響，旨在尋找一種能提高BMSCs存活并促進(jìn)其分化的干預(yù)因子，為在體研究提供相關(guān)理論依據(jù)。

材料和方法

1 動(dòng)物

健康Wistar遠(yuǎn)交群大鼠，6-7周齡雄鼠，體重160-170 g左右。山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

2 試劑

MCA 購自江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司;PKA抑制劑H89 購自 Sigma;PrimeScript RT reagent kit、SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒購自TaKaRa;兔抗大鼠心肌鈣蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)IgG購自Santa cruz;大鼠環(huán)磷酸腺苷ELISA試劑盒購自RapidBio。5-氮雜胞苷(5-azacytidine，5-Aza)購自Sigma。

3 方法

3.1 BMSCs的分離、培養(yǎng)和鑒定 將大鼠斷頸處死，用75%乙醇浸泡10 min，無菌取雙側(cè)股、脛骨，去除附著組織，剪去骨的兩端，接裝有PBS的注射器，反復(fù)沖出骨髓至骨體變白。沖出的骨髓吹打成細(xì)胞懸液后，以1 500 r/min離心10 min后，棄去上清，在沉淀中加入適量DMEM培養(yǎng)液，吹打成細(xì)胞懸液并接種于培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。72 h首次換液，以后每2-3 d換液1次。待細(xì)胞長滿瓶底的80%以上時(shí)，用0.25%胰酶消化，按1∶2或1∶3比例傳代備用。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)BMSCs的表面標(biāo)志 CD71、CD44、CD45。

3.2 各濃度梯度MCA-細(xì)胞培養(yǎng)液的配制 取MCA原液濃度為5.72×10-2mol/L。用細(xì)胞培養(yǎng)液配制成濃度分別為1 ×10-2mol/L、1 ×10-3mol/L、10-4mol/L、10-5mol/L、1 ×10-6mol/L和1×10-7mol/L的MCA細(xì)胞培養(yǎng)液。

3.3 MTT比色法 取第3代細(xì)胞消化后，用含血清的培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板，加入含6個(gè)濃度梯度的MCA細(xì)胞培養(yǎng)液，分別培養(yǎng)24 h、48 h。加入MTT(5.0 g/L)10 μL/well、置入培養(yǎng)箱孵育4 h，離心棄上清，加入二甲基亞砜200 μL，采用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定各孔吸光值(A值)。增殖抑制率=1-(實(shí)驗(yàn)孔A值-空白孔A值)/(對(duì)照孔A值-空白孔A值)，根據(jù)增殖抑制率評(píng)價(jià)對(duì)細(xì)胞活性的影響。

3.4 ELISA測(cè)定細(xì)胞內(nèi)cAMP水平 取第3代細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)，分別給予10-3、10-4、10-5mol/L MCA無血清細(xì)胞培養(yǎng)液，于給藥后 2 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h 收集細(xì)胞:吸棄培養(yǎng)液，冰 PBS沖洗1次，加入0.05 mol/L HC1(1010/L)，10 min左右終止反應(yīng)。待細(xì)胞溶解后收集細(xì)胞，調(diào)整pH值至7.0，4℃、1 200 r/min離心10 min，取上清。按照大鼠環(huán)磷酸腺苷ELISA試劑盒說明測(cè)定細(xì)胞內(nèi)cAMP水平。

3.5 各濃度MCA誘導(dǎo)BMSCs分化 取第3代細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)，分別給予 10-3mol/L、10-4mol/L、10-5mol/L MCA細(xì)胞培養(yǎng)液干預(yù)24 h，后換成普通培養(yǎng)液，培養(yǎng)至1周，收集細(xì)胞利用熒光定量PCR法測(cè)定心肌特異性基因表達(dá)情況。

3.6 10-3mol/L MCA作用不同時(shí)間對(duì)BMSCs分化的影響取第3代BMSCs，待完全貼壁，換成10-3mol/L MCA細(xì)胞培養(yǎng)液，分別干預(yù)1、3、5、7、9 d。同時(shí)給予 10 μmol/L 5-Aza 細(xì)胞培養(yǎng)液誘導(dǎo)24 h作為陽性對(duì)照和普通培養(yǎng)液作為空白組。各組誘導(dǎo)時(shí)間結(jié)束后更換為普通培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)至4周，收集細(xì)胞。利用熒光定量PCR法測(cè)定心肌特異性基因表達(dá)情況。

3.7 BMSCs分化率測(cè)定 取第3代BMSCs，接種于6孔板內(nèi)。實(shí)驗(yàn)共分3組:10-3mol/L MCA組、5-Aza組和空白組，培養(yǎng)2周后，采用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定cTnI陽性標(biāo)記的細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分比。

3.8 PKA抑制劑H89對(duì)MCA誘導(dǎo)BMSCs分化的影響 取第3代BMSCs，接種于6孔板內(nèi)。實(shí)驗(yàn)共分3組:(1)MCA組:給予10-3mol/L MCA的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)3 d;(2)H89+MCA組:給予25 μmol/L H89培養(yǎng)液30 min，再換成 10-3mol/L MCA誘導(dǎo)培養(yǎng)液培養(yǎng)3 d;(3)空白組:給予普通培養(yǎng)液培養(yǎng)。各組誘導(dǎo)時(shí)間結(jié)束后更換為普通培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)至4周，收集細(xì)胞測(cè)定心肌特異性基因表達(dá)情況。

3.9 熒光定量PCR測(cè)定心肌特異性基因表達(dá) 提取細(xì)胞總RNA，RT反應(yīng)條件:37℃ 15 min(RT)，85℃ 5 s(反轉(zhuǎn)錄酶的失活反應(yīng))。紫外吸收測(cè)定法測(cè)定cDNA計(jì)算濃度。按組份配制熒光定量PCR反應(yīng)液，進(jìn)行real-time PCR反應(yīng):擴(kuò)增程序及參數(shù)為:預(yù)變性 Reps 1，95℃ 30 s;PCR反應(yīng):Reps 40，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30-34 s;Reps 1，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min。使用StepOne軟件中的Design Wizard工作流程設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，為實(shí)驗(yàn)輸入設(shè)計(jì)參數(shù)。Applied Biosystems儀器運(yùn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果判定及計(jì)算:(1)熔解曲線:Tm值＞80℃，單峰認(rèn)為擴(kuò)增為特異性;(2)相對(duì)定量結(jié)果計(jì)算(2-ΔΔCt法):ΔCt目的基因=Ct目的基因-CtGAPDH，ΔΔCt=ΔCt目的基因-ΔCt對(duì)照組。引物序列見表1。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

表1 引物序列Table 1.Sequences for primers

結(jié) 果

1 BMSCs生長特性及鑒定

培養(yǎng)1 d后可見到少量細(xì)胞貼壁;培養(yǎng)第3 d大部分細(xì)胞為梭形或多角形細(xì)胞呈貼壁生長;7 d可見散在分布的形態(tài)相對(duì)均一的梭形細(xì)胞，部分排列呈現(xiàn)有規(guī)則的集束輻射狀;15 d到20 d細(xì)胞基本融合，呈漩渦狀排列，細(xì)胞之間界限不清。傳代的細(xì)胞形態(tài)類似成纖維細(xì)胞，生長分布均勻，傳代后細(xì)胞增殖速度明顯增快，多次傳代后細(xì)胞形態(tài)均一，見圖1。流式細(xì)胞儀檢測(cè)BMSCs表面標(biāo)志結(jié)果顯示:貼壁生長的細(xì)胞表達(dá) CD44(98.46%)和 CD71(68.63%)，而不表達(dá)CD45(1.24%)，見圖 2。

2 MCA對(duì)BMSCs細(xì)胞活性的影響

Figure 1.Phase contrast microscopic observation of cultured BMSCs(×200):A，B:primary BMSCs after 2 weeks and 3 weeks，respectively;C，D:passage 3 BMSCs after 24 h and 1 week，respectively.圖1 BMSCs的生長形態(tài)

Figure 2.The surface marker of passage 3 BMSCs detected by flow cytometry.CD44 and CD71 were positive，while CD45 was negative.圖2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)BMSCs表面標(biāo)志CD44、CD71和CD45的表達(dá)

隨著MCA濃度的逐漸增大，A490逐漸減小。10-2、10-3、10-4、10-5mol/L濃度組A值與空白組相比差異顯著(P＜0.05);10-6、10-7mol/L濃度組A值與空白組相比無顯著差異(P＞0.05)。通過公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率均為負(fù)值，表明不同濃度的該藥物對(duì)BMSCs的活性呈抑制作用，并表現(xiàn)為時(shí)間和劑量依賴性，其中10-2mol/L MCA對(duì)細(xì)胞的抑制作用尤為顯著，見表2。

3 MCA對(duì)BMSCs細(xì)胞內(nèi)cAMP水平的影響

各濃度組在各時(shí)點(diǎn)的細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度較空白組明顯升高，且隨著MCA濃度的升高，細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度也升高。比較各時(shí)點(diǎn)cAMP濃度，發(fā)現(xiàn)給藥6 h后cAMP濃度達(dá)高峰，隨后逐漸下降，至72 h最低，見表3。

4 MCA干預(yù)后對(duì)BMSCs表達(dá)心肌特異性基因的影響

GATA-4、β-MHC和Cx43 mRNA的表達(dá)在MCA各濃度組與空白組相比都有所升高(P＜0.05);其中GATA-4、β-MHC mRNA在MCA10-3mol/L組明顯高于其它2個(gè)濃度組，差異顯著(P＜0.05)。Cx43 mRNA表達(dá)量在MCA 10-5mol/L最高，其次是MCA 10-3mol/L組(P＜0.05)，見表4。

表2 各濃度MCA作用24 h和48 h對(duì)BMSCs活性的影響Table 2.The effect of different concentrations of MCA on viability of BMSCs in 24 h and 48 h(±s.n=18)

表2 各濃度MCA作用24 h和48 h對(duì)BMSCs活性的影響Table 2.The effect of different concentrations of MCA on viability of BMSCs in 24 h and 48 h(±s.n=18)

*P＜0.05 vs blank group;#P＜0.05 vs MCA 10-2mol/L group.

Group 24 h 48 h Blank 0.569±0.077 0.687±0.035 MCA 10-2mol/L 0.481±0.039* 0.485±0.017*MCA 10-3mol/L 0.502±0.017*# 0.521±0.013*#MCA 10-4mol/L 0.515±0.042*# 0.546±0.014*#MCA 10-5mol/L 0.539±0.049*# 0.554±0.012*#MCA 10-6mol/L 0.551±0.015 0.574±0.019 MCA 10-7mol/L 0.561±0.025 0.591±0.044

表3 各濃度MCA在各作用時(shí)點(diǎn)BMSCs細(xì)胞內(nèi)cAMP水平Table 3.The cAMP level in BMSCs treated with different concentrations of MCA at different time points(nmol/L.±s.n =6)

表3 各濃度MCA在各作用時(shí)點(diǎn)BMSCs細(xì)胞內(nèi)cAMP水平Table 3.The cAMP level in BMSCs treated with different concentrations of MCA at different time points(nmol/L.±s.n =6)

*P ＜0.05 vs blank group.

Group 2 h 6 h 12 h 24 h 48 h 72 h MCA 10-3mol/L 32.12±0.47* 47.27±0.34* 37.19±0.33* 34.41±0.24* 33.43±0.20* 30.01±0.39*MCA 10-4mol/L 22.29±0.39* 33.02±0.30* 28.86±0.25* 28.73±0.21* 21.95±0.56* 19.73±0.36*MCA 10-5mol/L 15.87±0.35* 27.21±0.42* 26.03±0.31* 25.32±0.19* 20.28±0.36* 15.06±0.27*Blank 5.34±0.17 5.84±0.12 5.41±0.34 5.32±0.31 5.38±0.16 5.65±0.42

表4 各濃度MCA對(duì)BMSCs心肌特異性基因表達(dá)的影響Table 4.Expression of myocardium-specific genes after different concentrations of MCA induced BMSCs into myocardium(±s.n=6)

表4 各濃度MCA對(duì)BMSCs心肌特異性基因表達(dá)的影響Table 4.Expression of myocardium-specific genes after different concentrations of MCA induced BMSCs into myocardium(±s.n=6)

*P＜0.05 vs blank group;#P＜0.05 vs MCA 10-4mol/L group and 10-5mol/L group.

Group GATA-4 mRNA β-MHC mRNA Cx43 mRNA Blank 0.86±0.46 0.65±0.38 0.83±0.19 MCA 10-3mol/L 33.08±1.77*#22.98±6.36*# 7.51±0.61*MCA 10-4mol/L 4.79±0.63* 14.32±4.34* 3.98±1.31*MCA 10-5mol/L 2.56±0.32* 7.95±2.71* 12.19±0.42*

5 MCA作用不同時(shí)點(diǎn)心肌特異性基因的表達(dá)

10-3mol/L MCA作用3 d和5 d的2組在培養(yǎng)4周時(shí)GATA-4、β-MHC、Cx43 mRNA表達(dá)量高于其它3組(P＜0.05)。其中MCA誘導(dǎo)3 d組略高于誘導(dǎo)5 d組，見表5。

表5 10－3mol/L MCA誘導(dǎo)不同時(shí)點(diǎn)BMSCs心肌特異性基因的表達(dá)Table 5.Expression of myocardium-specific genes after 10-3 mol/L MCA induced BMSCs into myocardium in different time points(±s.n=6)

表5 10－3mol/L MCA誘導(dǎo)不同時(shí)點(diǎn)BMSCs心肌特異性基因的表達(dá)Table 5.Expression of myocardium-specific genes after 10-3 mol/L MCA induced BMSCs into myocardium in different time points(±s.n=6)

*P＜0.05 vs 1 d group;#P＜0.05 vs 7 d and 9 d group;▲P＜0.05 vs 5 d group.

Induction time Cultured 4weeks GATA-4 mRNA β-MHC mRNA Cx43 mRNA 1 d 49.12±3.17 42.22±3.77 19.93±1.43 3 d 74.69±4.36*# 65.44±4.04*#▲ 30.12±2.19*#▲5 d 70.18±3.05*# 59.88±3.12*# 25.45±1.56*#7 d 62.62±3.55* 40.76±3.16* 17.70±2.42*9 d 57.36±5.16* 39.68±2.94* 10.75±4.11*

6 MCA和5－Aza對(duì)BMSCs分化作用的比較

MCA組、5-Aza組與空白組相比，GATA-4、β-MHC和Cx43 mRNA的表達(dá)增高;GATA-4和β-MHC mRNA在MCA組較5-Aza組的表達(dá)量增多(P＜0.01)，見表6。流式細(xì)胞儀測(cè)定誘導(dǎo)分化率:MCA組誘導(dǎo)分化率略高于5-Aza組的誘導(dǎo)分化率(20.24% ±1.02%vs 18.39% ±0.58%，P＜0.05)。

7 給予PKA抑制劑H89對(duì)心肌特異性基因表達(dá)的影響

MCA組與空白組相比GATA-4、β-MHC和Cx43 mRNA的表達(dá)量顯著增加(P＜0.01);給予H89后，H89+MCA組GATA-4、β-MHC和Cx43 mRNA的表達(dá)量較MCA組顯著減少(P＜0.01);GATA-4、β-MHC和 Cx43 mRNA這3種基因在H89+MCA組也有所表達(dá)，并且與空白組相比有顯著差異(P＜0.01)，見表7。

表6 比較MCA和5－Aza誘導(dǎo)BMSCs后心肌特異性基因的表達(dá)情況Table 6.Expression of myocardium-specific genes after MCA or 5-Aza induced BMSCs into myocardium(±s.n=6)

表6 比較MCA和5－Aza誘導(dǎo)BMSCs后心肌特異性基因的表達(dá)情況Table 6.Expression of myocardium-specific genes after MCA or 5-Aza induced BMSCs into myocardium(±s.n=6)

*P＜0.05 vs blank group;#P＜0.05 vs 5-Aza group.

Group GATA-4 mRNA β-MHC mRNA Cx43 mRNA Blank 0.69±0.51 0.86±0.12 1.31±0.19 MCA 51.31±2.33*# 30.94±2.13*# 15.80±1.39*5-Aza 35.48±2.24* 19.06±1.54* 11.86±1.02*

表7 給予PKA抑制劑H89干預(yù)MCA誘導(dǎo)BMSCs后心肌特異性基因的表達(dá)情況Table 7.Expression of myocardium-specific genes with PKA inhibitor H89 treatment after MCA induced BMSCs into myocardium(±s.n=6)

表7 給予PKA抑制劑H89干預(yù)MCA誘導(dǎo)BMSCs后心肌特異性基因的表達(dá)情況Table 7.Expression of myocardium-specific genes with PKA inhibitor H89 treatment after MCA induced BMSCs into myocardium(±s.n=6)

*P＜0.05 vs blank group;#P＜0.05 vs MCA group.

Group GATA-4 mRNA β-MHC mRNA Cx43 mRNA MCA 33.08±1.27* 30.94±2.13* 15.80±1.39*H89+MCA 15.63±0.64*# 10.46±1.13*# 4.46±0.62*#Blank 0.86±0.46 0.65±0.38 1.14±0.74

討 論

BMSCs能夠分化為心肌細(xì)胞早已被國內(nèi)外學(xué)者所認(rèn)識(shí)，并有大量國內(nèi)外研究證實(shí)其能分化為心肌細(xì)胞[2]，分化的細(xì)胞具有相似的動(dòng)作電位和形成閏盤結(jié)構(gòu)[3]。但是BMSCs移植中存在一些影響治療效果的問題，如移植細(xì)胞存活率低、分化率低。目前公認(rèn)的能誘導(dǎo)BMSCs分化為心肌細(xì)胞的化學(xué)誘導(dǎo)劑是5-Aza，其誘導(dǎo)分化率最高也僅30%，但是其有毒不能用于在體的誘導(dǎo)分化[4]，因此大批的學(xué)者致力于探究能用于人體的、提高BMSCs定向分化因素的研究[5]。

cAMP是體內(nèi)重要的第二信使，參與細(xì)胞的代謝、生長、分化和凋亡等[6]。經(jīng)典的 cAMP主要是通過蛋白激酶 A(protein kinase A，PKA)信號(hào)通路發(fā)揮作用。研究已證實(shí)cAMP/PKA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路能促進(jìn)心肌早期轉(zhuǎn)錄因子GATA-4[7，8]和連接蛋白 Cx43的表達(dá)。GATA-4是干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化的重要啟動(dòng)因素[9]，參與調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)基因和相關(guān)調(diào)控基因的表達(dá)。Cx43具有非通訊功能，可調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、增殖、分化、凋亡等生物學(xué)過程[10]。研究表明增加細(xì)胞內(nèi)cAMP的水平能促進(jìn)Cx43的磷酸化，增加Cx43的表達(dá)以及調(diào)控Cx43的細(xì)胞間通訊[11]。MCA是環(huán)磷酸腺苷類似物，葡胺作為配基與cAMP結(jié)合，可增強(qiáng)cAMP的脂溶性，使cAMP易于通過細(xì)胞膜，提高細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度，使cAMP的作用得到充分的發(fā)揮[12，13]?；谝陨系睦碚撘罁?jù)，本課題從細(xì)胞水平研究MCA對(duì)BMSCs向心肌細(xì)胞分化的影響，以期為提高干細(xì)胞移植的臨床療效提供新思路和靶點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)觀察到隨著MCA濃度的逐漸增大，細(xì)胞活性逐漸減少，說明該藥物對(duì)BMSCs的活性呈抑制作用。在抑制細(xì)胞活性的過程中，沒有觀察到細(xì)胞死亡現(xiàn)象。MCA抑制BM-SCs活性表現(xiàn)為時(shí)間和劑量依賴性。研究表明MCA能夠通過細(xì)胞膜進(jìn)入BMSCs細(xì)胞內(nèi)，升高細(xì)胞內(nèi)cAMP的濃度，且呈濃度依賴性。研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)MCA干預(yù)后BMSCs心肌特異性基因GATA-4、β-MHC和Cx43表達(dá)增多，表明MCA具有誘導(dǎo)BMSCs向心肌樣細(xì)胞分化的能力。深入研究其量效關(guān)系，可見10-3mol/L濃度的MCA誘導(dǎo)干預(yù)3 d能發(fā)揮最佳的誘導(dǎo)分化作用。同時(shí)研究中也發(fā)現(xiàn)不是誘導(dǎo)的時(shí)間越長誘導(dǎo)效果越好，這可能與環(huán)磷酸腺苷對(duì)細(xì)胞分化的復(fù)雜作用有關(guān)。目前公認(rèn)的化學(xué)誘導(dǎo)劑為5-Aza，因此我們選用5-Aza作為陽性對(duì)照，運(yùn)用熒光定量RT-PCR法比較心肌特異性基因表達(dá)量和流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定兩者干預(yù)后BMSCs表達(dá)心肌特異性cTnI的陽性細(xì)胞率，可見MCA組表達(dá)量和陽性細(xì)胞略高于5-Aza組，再一次說明MCA有誘導(dǎo)分化的作用，且這種作用略強(qiáng)于5-Aza。

cAMP對(duì)細(xì)胞的生物效應(yīng)主要是通過激活PKA來實(shí)現(xiàn)。PKA屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，通過磷酸化調(diào)節(jié)多種蛋白質(zhì)，包括轉(zhuǎn)錄因子的活性，對(duì)細(xì)胞分化和生長起著調(diào)節(jié)作用。經(jīng)典的cAMP/PKA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路為:cAMP→依賴cAMP的蛋白激酶A(PKA)→基因調(diào)控蛋白→基因轉(zhuǎn)錄。目前有關(guān)cAMP/PKA通路與干細(xì)胞向心肌細(xì)胞的分化沒有受到關(guān)注，更沒有與臨床應(yīng)用藥物相結(jié)合。有報(bào)道[14]在培養(yǎng)基中加入不同濃度的cAMP與胚胎干(embryonic stem，ES)細(xì)胞共同培養(yǎng)，能增加搏動(dòng)細(xì)胞的數(shù)量，RT-PCR分析顯示ES細(xì)胞在經(jīng)與cAMP聯(lián)合培養(yǎng)后能表達(dá)心肌細(xì)胞特異性標(biāo)記物GATA-4、NKX2.5、β-MHC和ANF。但在這項(xiàng)研究中沒能就誘導(dǎo)分化的機(jī)制進(jìn)行深入探討。

H89是一種常用的PKA抑制劑，可以通透細(xì)胞，選擇性抑制cAMP依賴的蛋白激酶PKA、PKG和PKCμ，但對(duì)于PKA的選擇性抑制作用更強(qiáng)。本研究中給予H89作用30 min后，再用MCA誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)心肌特異性基因GATA-4、Cx43和β-MHC mRNA表達(dá)明顯減少;雖然有H89的抑制作用，但是仍發(fā)現(xiàn)BMSCs還能少量表達(dá)GATA-4、Cx43和β-MHC mRNA，說明H89能部分抑制MCA的誘導(dǎo)分化的作用，這與cAMP除了主要通過cAMP/PKA信號(hào)通路發(fā)揮作用，還可通過其它信號(hào)通路(如ERK通路)發(fā)揮作用有關(guān)，這些相關(guān)信號(hào)通路的作用有待深入研究。

從以上結(jié)果，我們可以推論MCA可以進(jìn)入BMSCs內(nèi)，升高細(xì)胞內(nèi)cAMP水平，主要通過cAMP/PKA信號(hào)通路發(fā)揮誘導(dǎo)分化作用。至于BMSCs分化為心肌細(xì)胞的具體機(jī)制尚需深入研究。

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