竇橙云， 王蔚琛， 曹創(chuàng)杰， 魏樹(shù)珍， 李瑞峰△

(1山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)研究所，山東濟(jì)南250012;2濱州醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，山東煙臺(tái)264003;3濟(jì)南市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科，山東濟(jì)南250013)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病微血管病變導(dǎo)致的腎小球硬化，是糖尿病(diabetes mellitus，DM)的主要并發(fā)癥之一，也是DM常見(jiàn)的死亡原因之一。DN發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前普遍認(rèn)為DN涉及遺傳因素、糖代謝異常、血流動(dòng)力學(xué)異常、細(xì)胞因子調(diào)節(jié)障礙、炎癥介導(dǎo)、氧化應(yīng)激等多因素多環(huán)節(jié)，最近硝化應(yīng)激成為研究DN的熱點(diǎn)。

NO在眾多病理生理過(guò)程中發(fā)揮著介質(zhì)和信使的功能。胰島素抵抗(insulin resistance，IR)時(shí)，高血糖激活誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)產(chǎn)生過(guò)量NO，與超氧陰離子(O－·2)反應(yīng)生成過(guò)氧化亞硝酸鹽陰離子ONOO－，ONOO－與游離的酪氨酸或蛋白質(zhì)中的酪氨酸殘基反應(yīng)生成3－硝基酪氨酸(3－nitrotyrosine，3－NT)。3－NT是體內(nèi)活性氮簇(reactive nitrogen species，RNS)的生物標(biāo)志，其含量代表組織內(nèi)硝基化應(yīng)激的水平。3－NT具有細(xì)胞毒性，對(duì)蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和 DNA等具有很強(qiáng)的氧化能力，從而損傷組織。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)因胰島素受體底物 －1(insulin receptor substrate－1，IRS－1)的酪氨酸殘基被ONOO－硝基化，導(dǎo)致胰島素轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)中斷，造成高糖血癥。但鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)所誘導(dǎo)的出生當(dāng)天大鼠(neonatal－0 streptozotocin－induced rats，n0－STZ大鼠)體內(nèi)硝基化應(yīng)激狀況及腎損害機(jī)制還鮮有報(bào)道。

本課題組前期研究顯示單用川芎嗪或單用氨基胍治療，無(wú)論在降低n0－STZ大鼠空腹血糖、血漿胰島素及胰島素抵抗指數(shù)方面，還是降低血漿NO水平、iNOS表達(dá)、糖化血清蛋白方面，均不及兩藥合用效果顯著[1]。本研究擬進(jìn)一步觀察川芎嗪與氨基胍聯(lián)合應(yīng)用對(duì)n0－STZ大鼠腎損害的保護(hù)效果與機(jī)制。

材料和方法

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 出生當(dāng)日的Wistar大鼠100只，體重約60 g，山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。幼鼠先由母鼠喂養(yǎng)，4周齡后予普通飼料喂養(yǎng)，自由攝水?dāng)z食。室內(nèi)溫度控制在(22±3)℃，維持12/12 h的白天/黑夜交替。

1.2 試劑 STZ購(gòu)于Sigma;氨基胍購(gòu)于上海達(dá)瑞精細(xì)化學(xué)品有限公司;川芎嗪購(gòu)于天津藥業(yè)集團(tuán)新鄭股份有限公司;二甲雙胍由北京京豐制藥提供;3－NT(39－6)抗體為Santa Cruz產(chǎn)品;iNOSⅠ抗由北京博奧森生物技術(shù)有限公司提供;一氧化氮和一氧化氮合酶測(cè)定試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。

2 方法

2.1 n0－STZ大鼠模型制備 出生當(dāng)日的Wistar大鼠100只，隨機(jī)選取80只，一次性腹腔內(nèi)注射STZ 90 mg/kg，余20只作為正常對(duì)照組(NC)，腹腔內(nèi)注射等體積的生理鹽水。8周齡時(shí)，空腹血糖≥7.0 mmol/L者，選入本實(shí)驗(yàn)。將n0－STZ大鼠隨機(jī)分為胰島素抵抗(IR)組、二甲雙胍(MET)治療組、川芎嗪+氨基胍(TMP+AG)聯(lián)合治療組，每組20只，繼續(xù)喂養(yǎng)。MET組每日經(jīng)飲水?dāng)z入二甲雙胍125 mg/kg;TMP+AG組每日經(jīng)飲水?dāng)z入川芎嗪50 mg/kg、氨基胍25 mg/kg;分雌雄2組喂養(yǎng)24周，觀察大鼠一般情況。

2.2 血液生化檢查 32周齡，全部大鼠摘取眼球采血處死，留取血清、血漿檢測(cè)空腹血糖(fasting plasm glucose，F(xiàn)PG)、空腹胰島素(fasting insulin，F(xiàn)INS)。根據(jù)公式IRI=(FPG×FINS)/22.5計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)(insulin resistance index，IRI)。酶學(xué)法檢測(cè)血清尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)和肌酐(creatinine，Cr)。

2.3 尿液檢查 32周齡時(shí)，收集24 h尿液，測(cè)尿蛋白、尿肌酐。以內(nèi)生肌酐清除率反映腎小球?yàn)V過(guò)率(glomerular filtration rate，GFR):GFR=(尿肌酐 × 尿量)/血肌酐。

2.4 NO活性和iNOS濃度檢測(cè) 10%腎組織勻漿，依次加入試劑充分混勻，490 nm(NO)或530 nm(iNOS)波長(zhǎng)測(cè)各管吸光度值。

2.5 外周血白細(xì)胞iNOS mRNA檢測(cè) 提取白細(xì)胞，加入探針雜交液，anti－DIG －AP，NBT/BCIP，37℃避光顯色2 h，核固紅復(fù)染，封片。

2.6 HE染色 腎組織切片HE染色，觀察形態(tài)學(xué)變化。

2.7 免疫組化 常規(guī)脫蠟水化，Ⅰ抗4℃過(guò)夜(iNOS 1∶50;3 －NT 1∶100)，PBS 代替Ⅰ抗作陰性對(duì)照，DAB顯色。

2.8 Western blotting檢測(cè) iNOS和3－NT 10%凝膠，加樣40 μg，電泳、濕轉(zhuǎn)、封閉、Ⅰ抗4 ℃過(guò)夜、Ⅱ抗37℃孵育1 h，暗室曝光顯影。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用GraphPad Prism 5軟件，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，各組間采用單因素方差分析，采用Kaplan－Meier法估計(jì)生存率，生存率曲線采用logrank檢驗(yàn)進(jìn)行假設(shè)檢驗(yàn)。

結(jié) 果

1 n0－STZ大鼠成模情況

8周齡時(shí)，80只大鼠中有66只FPG≥7.0 mmol/L，成模率為82.5%，死亡率為0。該組大鼠尿量增多，體重增加，皮毛色黃、缺少光澤，活動(dòng)量少，F(xiàn)PG、FINS和IRI明顯升高，接近IR疾病狀態(tài)。

2 各組大鼠生存率比較

32周齡時(shí)，NC組存活20只，存活率100%，IR組存活7只，存活率35%，MET組存活14只，存活率70%，TMP+AG組存活17只，存活率85%。IR組、MET組生存率明顯低于NC組(P＜0.05)，MET組和TMP+AG組生存率明顯高于IR組(P＜0.05)，MET組和TMP+AG組間生存率差異無(wú)顯著，見(jiàn)圖1。

Figure 1.The survival curves of rats in different groups.圖1 各組大鼠生存率曲線

3 各組大鼠FPG、FINS和IRI的變化

32周齡時(shí)IR組的FPG明顯高于NC組(P＜0.05)，MET組和TMP+AG組較IR組顯著下降(P＜0.05);IR組FINS高于NC組(P＜0.05)，TMP+AG組低于IR組(P＜0.05)，還低于MET組(P＜0.05)，但是高于NC組(P＜0.05)，表明和二甲雙胍相比，聯(lián)合治療更能顯著降低胰島素濃度;對(duì)于IRI，IR組明顯高于NC組，MET組和TMP+AG組遠(yuǎn)低與IR組(P＜0.05)，但是TMP+AG組的療效優(yōu)于MET組(P＜0.05)，說(shuō)明聯(lián)合治療在提高胰島素敏感性方面更具優(yōu)勢(shì)，見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠空腹血糖、空腹胰島素和胰島素抵抗指數(shù)水平Table 1.The levels of FPG，F(xiàn)INS and IRI of rats in different groups

4 各組大鼠腎功能變化

和NC組相比，IR組BUN、血Cr和尿蛋白的量顯著增加(P＜0.05)，GFR明顯下降(P＜0.05);MET組和TMP+AG組BUN、血清Cr、尿蛋白的量明顯低于IR組(P＜0.05)，GFR有所提高(P＜0.05);與MET組比較，TMP+AG組更能降低血清BUN、Cr和尿蛋白，提高腎小球的濾過(guò)功能(P＜0.05)，見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠血清尿素氮、血清肌酐、尿蛋白、腎小球?yàn)V過(guò)率的比較Table 2. Comparison of BUN，serum Cr，urine albumin and GFR among different groups

5 各組大鼠NO濃度和iNOS活性變化

IR組的NO濃度和iNOS活性較NC組明顯增加(P＜0.05)，TMP+AG組在降低NO濃度和iNOS活性方面稍強(qiáng)于MET組(P＜0.05)，見(jiàn)圖2。

Figure 2.The NO concentration(A)and iNOS activity(B)of rat in different groups.±s.NC:n=20;IR:n=7;MET:n=14;TMP+AG:n=17.*P ＜ 0.05 vs NC group;#P ＜0.05 vs IR group;△P ＜0.05 vs MET group.圖2 各組NO濃度和iNOS活性比較

6 原位雜交

NC組外周血白細(xì)胞無(wú)iNOS mRNA表達(dá)，IR組外周血白細(xì)胞iNOS mRNA表達(dá)增高，MET組陽(yáng)性率略低于IR組，TMP+AG組陽(yáng)性率顯著降低，見(jiàn)圖3。

Figure 3.The iNOS mRNA －positive cells in peripheral blood leucocyte(×1 000).The dark blue cells were positive ones.A，B，C，D:NC(0.0±0.0)，IR(37.61% ±9.81%)，MET(20.85% ±5.17%)and TMP+AG(13.33% ±3.80%)groups，respectively.圖3 外周血白細(xì)胞iNOS mRNA陽(yáng)性細(xì)胞

7 HE染色

NC組腎小管、腎小球結(jié)構(gòu)完整，組織形態(tài)學(xué)正常，IR組腎小管萎縮、退化、排列紊亂，間質(zhì)纖維組織增生，腎小球體積增大，系膜基質(zhì)含量增加，治療組形態(tài)較IR組有明顯改變，聯(lián)合治療組的組織學(xué)形態(tài)向正常狀態(tài)轉(zhuǎn)變，見(jiàn)圖4。

Figure 4.The HE staining of kidneys and immunohistochemical staining of iNOS and 3－NT in kidneys(×400).PBS was a negative control instead of primary antibodies.A，B，C，D:NC，IR，MET and TMP+AG groups，respectively.圖4 各組腎臟組織HE染色，3－NT、iNOS免疫組化染色

8 免疫組化

3－NT:NC組中腎小管可見(jiàn)少量的棕黃色顆粒，腎小球中未見(jiàn)表達(dá);IR組不僅棕黃色顆粒顯著增加，而且顆粒也增粗，但都集中在腎小管，腎小球仍未見(jiàn)。MET組的顆粒較IR組明顯減少，TMP+AG組的免疫染色較弱，接近于NC組，見(jiàn)圖4。

iNOS:NC組未見(jiàn)iNOS的表達(dá)，即棕黃色物質(zhì)的沉積。IR組腎小管中可見(jiàn)棕黃色物質(zhì)，MET組表達(dá)量減少，TMP+AG則明顯減少。4組腎小球中均未見(jiàn)表達(dá)，見(jiàn)圖4。

9 Western blotting結(jié)果

3－NT:NC組可表達(dá)一定量3－NT，但是IR組更多(P＜0.05);相較于IR組，MET組和TMP+AG組明顯減少(P＜0.05)，但MET組和TMP+AG組的差異不明顯，見(jiàn)圖5。

Figure 5.The expression of iNOS and 3－NT in each group.β－actin served as internal control.±s.NC:n=20;IR:n=7;MET:n=14;TMP+AG:n=17.*P ＜0.05 vs NC group;#P ＜0.05 vs IR group;△P ＜0.05 vs MET group.圖5 各組腎組織中iNOS、3－NT、β－actin的表達(dá)結(jié)果

iNOS:NC組表達(dá)量非常少，IR組明顯提高(P＜0.05)，MET組比 IR組減少(P＜0.05)，TMP+AG組進(jìn)一步減少(P＜0.05)，說(shuō)明聯(lián)合治療在降低iNOS含量方面優(yōu)于二甲雙胍(P＜0.05)，見(jiàn)圖5。

討 論

對(duì)于糖尿病及其并發(fā)癥的研究，建立合理的動(dòng)物模型非常重要?，F(xiàn)階段誘導(dǎo)T2DM模型的方法多種多樣，包括食物喂養(yǎng)、藥物誘導(dǎo)、病毒感染、手術(shù)損傷、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物等。與傳統(tǒng)的成年動(dòng)物模型不同的是，本研究用出生當(dāng)日的Wistar大鼠。注射STZ后的結(jié)果顯示，F(xiàn)PG、FINS和IRI在造模8周后與 NC組相比明顯升高。該模型除了不具備遺傳易感性，其它特征與臨床IR及T2DM的早期表現(xiàn)非常接近，且價(jià)格低廉、生存率高、制備周期短，是研究IR發(fā)生發(fā)展及防治的理想模型[2]。32周齡時(shí)，和NC組相比，IR組血BUN、血Cr、尿蛋白的量顯著增加，GFR明顯下降，HE染色顯示腎小管萎縮、退化、排列紊亂，間質(zhì)纖維組織增生，腎小球體積增大，系膜基質(zhì)含量增加。給予川芎嗪與氨基胍聯(lián)合治療后，腎功能及其形態(tài)學(xué)損傷均得到明顯改善，提示聯(lián)合治療可以延緩或阻止糖尿病大鼠腎功能和病理學(xué)損害。

有關(guān)糖尿病腎功能受損的詳盡機(jī)制尚沒(méi)有完全闡明。尿蛋白是DN的標(biāo)志，也是腎功能受損的一個(gè)重要的預(yù)測(cè)因子。國(guó)內(nèi)學(xué)者發(fā)現(xiàn)即使在DN的早期，足細(xì)胞的數(shù)目、密度以及細(xì)胞質(zhì)的覆蓋面積均明顯降低[3]，細(xì)胞間隙增大，微蛋白尿產(chǎn)生;巨噬細(xì)胞通過(guò)分泌白細(xì)胞介素 －1β(interleukin－1β，IL－1β)和腫瘤壞死因子 α(tumor necrosis factor α，TNF － α)，激活磷脂酰肌醇3－激酶(phosphatidylinositol 3－kinase，PI3K)/蛋白激酶 B(protein kinase B，PKB/Akt)信號(hào)通路，參與蛋白尿的形成。高糖誘導(dǎo)產(chǎn)生的自由基下調(diào)超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和谷胱甘肽過(guò)氧化酶(glutathione peroxidase，GSH －Px)的表達(dá)，激活 NF － κB[4]。NF － κB誘導(dǎo)糖尿病個(gè)體的腎小球系膜細(xì)胞、腎小管細(xì)胞、足細(xì)胞表達(dá)多種炎癥介質(zhì)，如TNF－α、IL－6，促進(jìn)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β1(transforming growth factor－β1，TGF －β1)的釋放引起系膜細(xì)胞的增殖和腎小管纖維化，還可以導(dǎo)致腎臟炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的加劇，進(jìn)一步惡化腎功能。適度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對(duì)機(jī)體有益[5]，但過(guò)度時(shí)會(huì)通過(guò)TNF受體相關(guān)因子2(TNF receptor－associated factor 2，TRAF－2)、真核起始因子(eukaryotic initiation factor，eIF)－α和活化轉(zhuǎn)錄因子6(active transcriptional factor，ATF6)－PI3K/Akt通路激活 NF－κB，引起腎功能障礙。Drel等[6]發(fā)現(xiàn)多聚 ADP－核糖多聚酶(poly ADP－ribose polymerase，PARP)的活化提高了尿中丙二醛和3－NT含量，參與DN的發(fā)生。PARP抑制劑通過(guò)減輕足細(xì)胞的丟失和TGF－β的增加，阻止STZ－DM大鼠的蛋白尿、腎小球系膜的增生和膠原沉著[7]，也提示 PRAP參與DN的發(fā)生。本研究從NO、iNOS和3－NT三者間的相互關(guān)系出發(fā)，證實(shí)IR組不僅外周血白細(xì)胞iNOS mRNA表達(dá)增高，而且腎組織中NO濃度增加，iNOS活性升高，iNOS和3－NT表達(dá)增多。IR時(shí)不僅存在過(guò)多的NO，而且由于生成3－NT的過(guò)程中消耗了NO，造成iNOS活性升高，進(jìn)一步刺激NO生成，形成惡性循環(huán)，進(jìn)而加重腎功能損害。

本研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍和聯(lián)合治療均能通過(guò)下調(diào)iNOS的活性，降低NO的濃度，減少3－NT的生成，明顯改善n0－STZ大鼠的腎功能，但聯(lián)合治療效果更優(yōu)，進(jìn)一步佐證DN腎功能的損傷程度的確與硝化應(yīng)激有關(guān)。但其藥理機(jī)制還未完全闡明。川芎嗪可降低糖尿病腎皮質(zhì)晚期糖晚期糖基化終產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)含量，抑制醛糖還原酶活性，調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白Bcl－2的表達(dá)，抑制腎臟細(xì)胞凋亡[8];減少 IL －6、TNF － α、TGF － β1等的表達(dá)，抑制成纖維細(xì)胞增殖和膠原蛋白合成，延緩腎小球硬化[9];減少蛋白尿排泄，降低腎間質(zhì)中骨橋蛋白表達(dá)，從而減輕腎間質(zhì)損害[10]。氨基胍是iNOS的抑制劑，抑制NO生成;可抑制糖基化牛血清白蛋白(AGE－BSA)的生物效應(yīng)，降低受激活調(diào)節(jié)正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌因子水平，降低尿白蛋白，減輕腎系膜增生和腎小球肥大[11];抑制大鼠腎組織Ⅳ型膠原和TGF－β的表達(dá)，增強(qiáng)BMP－7和Smad5的表達(dá)，拮抗腎間質(zhì)的纖維化[12];增加二酰甘油(diacylglycerol，DAG)激酶活性，促使DAG轉(zhuǎn)化為磷脂酸，降低DAG水平，下調(diào)PKC活性而保護(hù)腎臟[13];減少腎小球乳過(guò)氧化物酶水平，降低腎臟氧化應(yīng)激水平[14]。川芎嗪與氨基胍的聯(lián)合治療，不僅在抗氧化方面發(fā)揮協(xié)同作用，而且下調(diào)iNOS活性，抑制NO及3－NT生成，拮抗硝基化作用。聯(lián)合治療是否通過(guò)其它途徑緩解DN時(shí)的腎功能受損，還需要進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，川芎嗪與氨基胍的聯(lián)合治療可減輕DN的腎功能損傷，其機(jī)制之一可能與抑制硝化應(yīng)激有關(guān)，為DN發(fā)病機(jī)制的研究提供新的思路。

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