徐 霖， 納 寧， 陳 康， 曹開源， 袁廣卿， 傅 強， 朱蓓莉

(中山大學中山醫(yī)學院1 免疫學教研室3微生物學教研室，廣東 廣州510080;2中山大學附屬第三醫(yī)院腎移植科，廣東 廣州510630;4 東莞市衛(wèi)生學校，廣東 東莞523000)

移植物抗宿主病(graft－versus－h(huán)ost disease，GVHD)是同種異基因骨髓移植(allogeneic bone marrow transplantation，allo－BMT)最主要的并發(fā)癥之一，在防治GVHD 的同時如何保留移植物抗白血病(graft－versus－leukemia，GVL)效應是目前臨床上開展骨髓移植和治療白血病需要解決的難題之一。研究表明某些特定亞群的樹突狀細胞(dendritic cells，DC)如淋巴系DC，如小鼠CD8α+DC 或人的漿細胞樣DC，或者未成熟DC(immature dendritic cells，iDC)可以產生免疫耐受作用［1，2］。同時供者DC 也能提呈次要組織相容性抗原活化T 細胞，介導產生移植物抗白血病(graft－versus－leukemia，GVL)作用［1，3］。我們前期研究中探索和改進了不成熟CD8α+DC 的制備方法［4－6］，體外和體內實驗已證明其具有一定抑制GVHD 的作用，同時不增加白血病復發(fā)［2，7，8］，但其GVL 作用仍有待進一步體外研究加以證實。因此本研究通過負載同種異基因白血病抗原的CD8α+DC 對同系T 細胞增殖、細胞因子分泌和殺傷等進行體外實驗，觀察不成熟CD8α+DC 是否能產生GVL 效應，為不成熟CD8α+DC 抗GVHD 并保留GVL 效應的機制和應用研究奠定基礎。

材 料 和 方 法

1 DC 的培養(yǎng)［4－6］

不成熟CD8α+DC(CD8α+iDC)組:C57BL/6 小鼠(H－2b)骨髓細胞以4 ×109/L 的濃度種于6 孔板中，加入細胞因子GM－CSF 5 μg/L，IL－4 20 μg/L、SCF 100 μg/L、Flt3L 25 μg/L 誘導DC，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱誘導2 d，于培養(yǎng)第3 d收獲不成熟CD8α+DC 細胞。

成熟DC(mature DC，mDC)對照組［7，9］:按文獻報道方法，C57BL/6 小鼠(H－2b)骨髓細胞以1 ×109/L 的濃度種于6 孔板，加入細胞因子GM－CSF 20 μg/L 和IL－4 10 μg/L，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)誘導8 d。于培養(yǎng)第3 d，第5 d 換液，培養(yǎng)第7 d 加入細胞因子至終濃度為GM－CSF 10 μg/L和TNF－α 10 μg/L 繼續(xù)誘導促DC 成熟。

2 EL9611 紅白血病細胞全抗原的制備

EL9611 紅白血病動物模型購自天津中國醫(yī)學科學院血液學研究所，由丁順利等［10］建立。傳代采用每只BALB/c 鼠尾靜脈注射經紅細胞裂解液處理的患鼠脾細胞2 ×106個，接種后小鼠平均存活時間(14.5 ±2.1)d，發(fā)病晚期(約12 d 左右)計數(shù)外周血白細胞(white blood cell，WBC)數(shù)目［2，10］。當WBC ＞3.0 ×1010/L 時將動物拉頸處死，取脾細胞，計數(shù)，以1×1011/L 濃度重懸于PBS 中，置－80 ℃、37 ℃反復凍融5次，每次10 min。凍融后的細胞懸液用超聲破碎儀以600 W超聲10 min，間隔5 s 對樣品中所含DNA 進行剪切，4 ℃12 000 r/min離心10 min，取上清用0.22 μm 的針頭濾器過濾，－20 ℃保存。

3 抗原沖擊與混合淋巴細胞反應(mixed lymphocyte reaction，MLR)［7，8］

CD8α+iDC 組和mDC 對照組均于培養(yǎng)最后1 d 加入蛋白含量終濃度為0 mg/L、2.5 mg/L、5 mg/L、10 mg/L、20 mg/L 經抽濾除菌的EL9611 紅白血病(H－2d)全抗原進行沖擊，繼續(xù)培養(yǎng)36 h，使DC 細胞提呈抗原成分。

MLR 以DC 作為刺激細胞，同系T 細胞作為反應細胞。分組如下:實驗組:每孔加2 ×105個反應細胞，按與反應細胞比例為1∶1、2∶1、4∶1(分別為2 ×105、4 ×105、8 ×105cells/well)加入經終濃度25 mg/L 絲裂霉素處理2h 的刺激細胞，每組設3 個平行孔;刺激細胞對照組:每孔加2 ×105、4 ×105、8 ×105個經絲裂霉素處理的刺激細胞，不加反應細胞，每組設3 個平行孔;反應細胞對照組:未加刺激細胞的2 ×105個反應細胞/well?？瞻捉M:每孔加100 μL 培養(yǎng)基。37 ℃、5%CO2培養(yǎng)3 d，采用MTT 法檢測。各實驗孔A 值為減去反應細胞對照孔A 值、刺激細胞對照孔A 值和培養(yǎng)基空白孔A 值后的A 值平均值。

4 MLR 培養(yǎng)上清中γ－干擾素(interferon－γ，IFN－γ)和白細胞介素－10(interleukin－10，IL－10)的檢測

收集混合淋巴細胞培養(yǎng)上清，ELISA 法測定培養(yǎng)上清中IFN－γ 和IL－10 含量。試劑盒復溫30 min 后，各孔分別加入倍比稀釋的標準品、適度稀釋的上清樣品及陰性對照。每組設3 個平行孔，100 μL/well，37 ℃濕盒孵育2 h，洗滌5 次;加入生物素抗體工作液100 μL/well，37 ℃1 h，洗滌5 次后加入酶結合工作液100 μL/well，37 ℃30 min，洗滌后加顯色劑100 μL/well，37 ℃顯色15 min;加終止液后10 min 內于酶標儀上450 nm 波長處讀A 值。結果計算:標準品孔A 值和樣品孔A 值分別減去陰性對照孔A 值。標準曲線根據(jù)標準品的A 值和標準品細胞因子含量繪制;樣品中細胞因子的含量通過標準曲線和標準曲線方程進行確定。

5 CD8α+iDC 誘導T 淋巴細胞的活化

Ag 沖擊后的CD8α+iDC 經絲裂霉素C 處理2h，DMEM完全培養(yǎng)基洗滌3 次后，計數(shù)備用。取靜置1 h 后去除巨噬細胞的C57BL/6(H－2b)的脾細胞，計數(shù)，備用。根據(jù)混合淋巴細胞反應(MLR)的結果，按CD8α+DC/T 1∶1 的比例，混合DC 和T 細胞后置于6 孔板中，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)第1 d、第3 d 加入終濃度為5 ×105U/L 重組小鼠IL－2維持T 細胞活性。以未加DC 刺激的C57BL/6 小鼠的T 細胞作為殺傷實驗的陰性對照。

6 T 細胞殺傷實驗

7 統(tǒng)計學處理

結 果

1 EL9611 抗原沖擊CD8α+iDC 實驗組刺激同系小鼠T 細胞增殖的情況

EL9611 抗原沖擊后CD8α+iDC 刺激T 細胞增殖隨CD8α+iDC/T 刺激比例增加而增強，1∶1、2∶1 和4∶1 各比例組刺激T 細胞增殖的作用呈梯度增加，各組間差別顯著(P ＜0.05)，見圖1;在CD8α+iDC/T 比例為1∶1 組中，當抗原沖擊濃度為2.5 mg/L 和5 mg/L 時刺激T 細胞增殖作用達到最大，且這2 種濃度之間無顯著差別(P ＞0.05)。在CD8α+iDC/T 比例為2∶1 和4∶1 組中，當抗原沖擊濃度為5 mg/L 時刺激T 細胞增殖的作用最強。不同比例組在抗原沖擊濃度為20 mg/L 時，刺激T 細胞增殖的作用趨于平穩(wěn)。以上結果顯示低濃度抗原(≤5 mg/L)沖擊CD8α+iDC 后刺激T 細胞增殖的作用較強，采用低濃度抗原沖擊可能更有利于CD8α+iDC 的GVL 效應。

2 EL9611 抗原沖擊mDC 對照組刺激同系小鼠T 細胞增殖的情況

EL9611 抗原沖擊后mDC 刺激T 細胞增殖趨勢與CD8α+iDC 組類似，隨mDC/T 比例的增加，T 細胞的增殖能力增強，各比例組間的差別顯著(P ＜0.05)，見圖2。各比例組均在抗原沖擊濃度為20 mg/L 時顯示最弱的刺激T 細胞增殖能力(P ＜0.05);其它各抗原沖擊濃度組(0 mg/L、2. 5 mg/L、5 mg/L、10 mg/L)刺激T 細胞增殖的能力無顯著差別(P ＞0.05)，抗原濃度的變化對mDC 刺激T 細胞增殖能力的影響不明顯。

Figure 1. The proliferation of syngeneic T cells stimulated by EL9611 antigen－pulsed CD8α+iDC in DC/T ratio of 1∶1，2∶1 and 4∶1 groups. ±s.n =3. * P ＜0.05 vs CD8α+ iDC/T 1∶1 group.圖1 EL9611 抗原沖擊的CD8α+iDC/T 1∶1、2∶1 和4∶1 組刺激T 細胞增殖情況

Figure 2. The proliferation of syngeneic T cells stimulated by EL9611 antigen－pulsed mDC in DC/T ratio of 1∶1，2∶1 and 4∶1 groups. ±s.n=3. * P ＜0.05 vs mDC/T 1∶1 group.圖2 EL9611 抗原沖擊的mDC/T 1∶1、2∶1 和4∶1 組刺激T細胞增殖情況

3 CD8α+iDC 與mDC 不同比例、不同濃度時對T 細胞刺激能力的比較

從圖1、2 可以看出，CD8α+iDC 刺激T 細胞增殖能力與沖擊抗原濃度有關，在抗原濃度2.5－5 mg/L 時達到最大，但mDC 未顯示此趨勢。未經EL9611 H－2d紅白血病抗原沖擊(即抗原沖擊濃度為0 mg/L)時，在DC/T 的各比例組中CD8α+iDC 刺激T 細胞增殖的能力均低于mDC(P ＜0.05)。當抗原沖擊濃度為2.5－5 mg/L 時，CD8α+iDC 刺激T 細胞增殖的能力各比例組中均高于mDC 對照組(P ＜0.05);當抗原沖擊濃度為10 mg/L 時，CD8α+iDC 各比例組刺激T 細胞增殖的能力均弱于mDC(P ＜0.05);而當抗原沖擊濃度進一步增加，達到20 mg/L 時，二者之間差別無顯著(P ＞0.05)。結果進一步表明低濃度抗原沖擊CD8α+iDC 刺激T 細胞增殖的效果較好。

4 EL9611 抗原沖擊的CD8α+iDC 與T 細胞共培養(yǎng)后IFN－γ 和IL－10 的分泌情況

EL9611 抗原沖擊的CD8α+iDC 與T 細胞共培養(yǎng)后，上清液細胞因子ELISA 檢測結果顯示，CD8α+iDC 經抗原沖擊后DC 細胞本身釋放一定量的IFN－γ 和IL－10，上清液中IFN－γ 含量為(28.9 ±4.5)ng/L，IL－10 含量為(45.5 ±11.0)ng/L。經與T 細胞共培養(yǎng)后，CD8α+iDC/T 不同比例組分泌IFN－γ 和IL－10 水平均明顯增高，差別顯著(P ＜0.05)。IL－10 的分泌在抗原沖擊濃度為10 mg/L 時達最高值，與其它濃度組比較差別顯著(P ＜0.05);而在抗原沖擊濃度為2.5 mg/L 和5 mg/L 時在各比例組中均達最低值(P ＜0.05)，見圖3、4。IFN－γ 的分泌在抗原沖擊濃度為2.5 mg/L 時濃度最高，而后顯示出下降趨勢，在1∶1 和2∶1 組當抗原濃度為5 mg/L 時分泌量最低(P ＜0.05)。結果提示，當沖擊抗原濃度為低濃度時(≤5 mg/L)時，IFN－γ 的分泌量較高而IL－10較低，較低的抗原沖擊濃度可能更有利于CD8α+iDC 與T 細胞共培養(yǎng)后發(fā)揮GVL 效應，結果與增殖實驗一致。

綜合細胞因子分泌和增殖反應的情況，我們發(fā)現(xiàn)，當抗原沖擊為5 mg/L 時，IL－10 分泌最低，T 細胞增殖活性達最大值;當抗原沖擊濃度為10 mg/L 時，IL－10 分泌最高，此時T 細胞增殖活性達最低，說明EL9611 抗原沖擊后CD8α+iDC刺激T 細胞的增殖活性與IL－10 的含量密切相關，這也提示IL－10 的分泌與CD8α+iDC 發(fā)揮GVL 效應存在一定的負相關關系。

Figure 3. Secretion of IFN－γ by T cells stimulated by EL9611 antigen－pulsed CD8α+iDC. ±s. n =3. * P ＜0.05 vs CD8α+iDC/T 1∶1，2∶1 and 4∶1 groups.圖3 EL9611 抗原沖擊后CD8α+iDC 刺激T 細胞分泌IFN－γ 的情況

Figure 4. Secretion of IL－10 by T cells stimulated by EL9611 antigen－pulsed CD8α+iDC. ±s. n =3. * P ＜0.05 vs CD8α+iDC/T 1∶1，2∶1 and 4∶1 groups.圖4 EL9611 抗原沖擊后CD8α+iDC 刺激T 細胞分泌IL－10 的情況

5 EL9611 抗原沖擊的CD8α+iDC 刺激同系T 細胞的殺傷活性

MLR 結果和細胞因子檢測結果顯示，EL9611 抗原沖擊濃度≤5 mg/L，EL9611 抗原沖擊CD8α+iDC/T 比例為1∶1 時，特異性T 細胞活化效果最佳，故以此條件作為殺傷實驗的反應條件。

EL9611 靶細胞特異性殺傷實驗結果顯示，殺傷率隨抗原沖擊濃度的增加而增強，當沖擊濃度為2.5 mg/L 時，殺傷率即可達90%，表現(xiàn)出較強的殺傷作用，表明CD8α+iDC 經同種異基因白血病抗原沖擊后能夠有效提呈白血病細胞的抗原成分，發(fā)揮GVL 效應，見圖5。EL9611 抗原特異性T 細胞對BALB/c正常脾細胞的非特異性殺傷實驗結果顯示，白血病特異T 細胞對正常脾細胞不產生顯著的殺傷作用，其殺傷率低于T 細胞陰性對照(未經CD8α+iDC 刺激的T 細胞，P ＜0.05)，見圖6，表明白血病特異性T 細胞在殺傷白血病細胞的同時對正常細胞不產生明顯的殺傷作用，其殺傷為抗原特異性殺傷，在清除白血病細胞的同時不引起正常細胞的損傷。

Figure 5. Specific cytotoxicity of EL9611 antigen－specific T cells on EL9611 cells. ±s.n=3.圖5 EL9611 抗原特異性T 細胞對EL9611 細胞的特異性殺傷實驗

Figure 6. Non－specific cytotoxicity of EL9611 antigen－specific T cells on BALB/c splenocytes.. ±s.n=3.圖6 EL9611 抗原特異性T 細胞對BALB/c 脾細胞的非特異性殺傷實驗

討 論

本課題組在前期研究中已通過GM－CSF+IL－4 +SCF+Flt3L 組合的方式成功制備出CD8α+iDC［4－6］，體外實驗表明其具有體外抑制同種MLR 的作用［7，8］，體內實驗發(fā)現(xiàn)同種異基因骨髓移植同時輸注CD8α+iDC 可減輕GVHD 病理損傷，延長小鼠存活期，同時不增加白血病復發(fā)［2］，推測CD8α+iDC 可能保留了部分GVL 效應。故本研究在不成熟CD8α+DC 抑制GVHD 作用機制體外研究的基礎上［7，8］，進一步探討CD8α+iDC 體外是否能夠產生一定的GVL 效應。

研究結果發(fā)現(xiàn)，沖擊抗原濃度對CD8α+iDC 刺激T 細胞增殖的能力有較明顯的影響，但mDC 刺激T 細胞增殖的能力較穩(wěn)定，抗原濃度對其影響較小。未經同種異基因白血病抗原沖擊之前，CD8α+iDC 刺激T 細胞增殖的作用明顯弱于mDC 對照組，但經小劑量(≤5 mg/L)抗原沖擊后其刺激T 細胞增殖的作用高于mDC。CD8α+iDC 刺激T 細胞增殖的能力隨CD8α+iDC/T 刺激比例增加而增強，在CD8α+iDC/T 比例為1∶1 而抗原沖擊濃度為2.5 mg/L、5 mg/L 時刺激T 細胞增殖的作用達到最大。因此，要最大限度地發(fā)揮CD8α+iDC抗GVHD 并保留GVL 效應時，低濃度抗原刺激將更有優(yōu)勢。

對CD8α+iDC 與T 細胞共培養(yǎng)的上清液進行細胞因子檢測發(fā)現(xiàn)，當沖擊抗原濃度為低濃度時(≤5mg/L)時，IFN－γ的分泌量較高而IL－10 較低，故較低的抗原沖擊濃度可能更有利于CD8α+iDC 與T 細胞共培養(yǎng)后發(fā)揮GVL 效應。而綜合細胞因子分泌和增殖反應結果后可以發(fā)現(xiàn)，上清中IL－10含量與CD8α+iDC 刺激T 細胞增殖的作用存在一定的負相關關系，提示IL－10 的分泌CD8α+mDC 抑制GVHD 并同時保留GVL 效應的平衡這一作用之間存在著密切的聯(lián)系，體系中保持合適濃度的IL－10 有利于產生抗GVHD 并同時保留GVL 的效應。雖然受者EL9611 紅白血病抗原沖擊后的CD8α+iDC 和mDC 都能夠刺激T 細胞增殖，但CD8α+iDC 由于能產生更多IL－10，能更好地發(fā)揮免疫調節(jié)作用，在GVHD防治中更具有應用價值。

殺傷實驗結果表明，EL9611 白血病抗原沖擊的CD8α+iDC 與T 細胞共培養(yǎng)，當沖擊濃度為2.5 mg/L 時，T 細胞對EL9611 靶細胞的殺傷率即可達90%，表現(xiàn)出了較強的殺傷作用。刺激增殖后的T 細胞能有效發(fā)揮殺傷紅白血病靶細胞的作用，同時不引起對正常細胞的非特異性殺傷，提示CD8α+iDC 在發(fā)揮GVL 的同時不會引起正常組織的損傷，殺傷作用具有抗原特異性。當抗原沖擊濃度為0 即未用抗原沖擊時，CD8α+iDC 即可刺激T 細胞產生殺傷作用，但這一作用是抗原非特異性的，從非特異性殺傷實驗的結果可以得到驗證。以上結果進一步證實CD8α+iDC 能夠提呈同種異基因的EL9611 白血病細胞抗原并產生特異性GVL 效應。

綜上所述，CD8α+iDC 可有效刺激抗原特異性T 細胞增殖并產生特異性殺傷效應，所具有的GVL 作用為CD8α+iDC在GVHD 防治中的進一步應用打下了良好的基礎，使其有可能成為抗GVHD 同時保留GVL 作用的一種治療手段，在同種異基因骨髓移植中顯示出潛在的應用價值。

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