盧建溪， 陽 莉， 錢師宇， 王 強(qiáng)

(1中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院疫苗研究所，廣東廣州510630;2暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣東廣州510632)

報(bào)告基因是指一組編碼易被檢測的蛋白質(zhì)或酶的基因，可通過報(bào)告基因的表達(dá)產(chǎn)物來“報(bào)告”目的基因的表達(dá)調(diào)控，作為一種靈敏度高、檢測簡便、結(jié)果可靠的技術(shù)手段，已廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、示蹤等分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究領(lǐng)域。目前，用于醫(yī)學(xué)研究的熒光蛋白主要有綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)和紅色熒光蛋白(red fluorescent protein，RFP)兩種，但RFP的應(yīng)用遠(yuǎn)沒有GFP廣泛。RFP是1999年由Matz等[1]從珊瑚蟲體內(nèi)分離出來的熒光蛋白，因其與GFP同源，可與GFP系列熒光蛋白共用，而且激發(fā)和發(fā)射波長更長，細(xì)胞內(nèi)成像背景低，而被迅速關(guān)注。RFP對GFP是一種很好的代替和補(bǔ)充，為細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)多熒光標(biāo)記提供了更多的熒光標(biāo)簽[2，3]。因此，本研究構(gòu)建了攜帶紅色熒光蛋白報(bào)告基因的重組腺病毒載體，并在體外測試其對腫瘤細(xì)胞的感染效率，以期為基因治療與基因疫苗研究提供另一種檢測工具。

材料和方法

1 材料

1.1 細(xì)胞與菌種 AD293細(xì)胞為本研究所保存。DH5α和Stbl2菌種購自Invitrogen。

1.2 質(zhì)粒 pShuttle－CMV、pTurboRFP－N 和 pH5'040.pkGFP－II為本研究所保存。

1.3 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基(Gibco);Lipofectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen);特級胎牛血清(Hyclone);限制性內(nèi)切酶及連接酶(TaKaRa);凝膠回收試劑盒、純化試劑盒及質(zhì)粒小提試劑盒(Omega);質(zhì)粒中量制備試劑盒(Qiagen)。

1.4 主要儀器 微量臺式離心機(jī)(Beckman)，核酸蛋白分析儀(Beckman)，熒光倒置顯微鏡(Nikon)，二氧化碳培養(yǎng)箱(Herarus)，生物安全柜(Thermo)，超低溫冰箱(Thermo)，電泳儀(上海天能科技公司)凝膠成像分析系統(tǒng)(Bio－Rad)。

2 方法

2.1 攜帶目的基因的腺病毒穿梭質(zhì)粒pShuttle－TurboRFPN的構(gòu)建 用核酸內(nèi)切酶Nhe I和Not I分別雙酶切攜帶目的基因RFP的質(zhì)粒pTurboRFP－N和腺病毒穿梭質(zhì)粒pShuttle－CMV，將酶切產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳后，切膠分別回收796 bp的目的基因RFP片段和線形的腺病毒穿梭質(zhì)粒pShuttle－CMV片段。用T4 DNA連接酶連接這2個(gè)片段，將純化后的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到超級感受態(tài)DH5α細(xì)胞中，涂布于含卡那霉素(50 mg/L)的LB平板上37℃倒置培養(yǎng)16 h。挑選菌落擴(kuò)增，試劑盒提取質(zhì)粒，用Nco I和Not I雙酶切鑒定篩選出含RFP基因的陽性克隆。

2.2 重組腺病毒載體 AdH5'.040.CMV.RFP － N 的構(gòu)建用核酸內(nèi)切酶I－Ceu I和PI－Sce I分別雙酶切腺病毒穿梭質(zhì)粒pShuttle－TurboRFP－N和骨架質(zhì)粒pH5'040.pkGFPII，將酶切產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳后，切膠分別回收含RFP基因的2 040 bp片段和31 873 bp骨架大片段。用T4 DNA連接酶連接這2個(gè)片段，構(gòu)成重組腺病毒載體AdH5'.040.CMV.RFP－N，將純化后的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化超級感受態(tài)Stbl2細(xì)胞，涂布于含氨芐青霉素(60 mg/L)的LB平板上37℃倒置培養(yǎng)16 h。在熒光顯微鏡下挑取無綠色熒光的菌落，經(jīng)過BstXⅠ初步酶切鑒定，有1個(gè)克隆出現(xiàn)預(yù)期條帶，該陽性克隆再經(jīng)HindⅢ和EcoRⅠ/SalⅠ酶切進(jìn)一步鑒定。篩選出的陽性克隆進(jìn)行質(zhì)粒中量制備，取12 μg的重組腺病毒載體AdH5'.040.CMV.RFP －N 用 PacⅠ酶切，使其完全線性化，暴露其反向末端重復(fù)序列(inverted terminal repeat，ITR)，用純化試劑盒純化酶切產(chǎn)物，置－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 重組腺病毒載體AdH5'.040.CMV.RFP－N的包裝和擴(kuò)增 根據(jù)Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒的使用說明，將線性化的AdH5'.040.CMV.RFP－N 轉(zhuǎn)染AD293細(xì)胞，轉(zhuǎn)染前1 d，將AD293細(xì)胞接種于6孔板中。轉(zhuǎn)染當(dāng)天，換無抗生素培養(yǎng)基，待細(xì)胞70% －90%融合時(shí)，加入DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物，轉(zhuǎn)染后4－6 h換完全培養(yǎng)基(含10%FBS，1%雙抗)。在熒光顯微鏡下逐日觀察RFP表達(dá)及細(xì)胞病變情況，至AD293細(xì)胞80%出現(xiàn)病變時(shí)收集細(xì)胞，在37℃水浴與－80℃超低溫冰箱之間反復(fù)凍融3次，10 000×g離心10 min，收集上清即病毒液，置－80℃作為毒種保留。將上述毒種反復(fù)感染293細(xì)胞來擴(kuò)增病毒，用CsCl2連續(xù)密度梯度離心法純化病毒液，透析后分裝。

2.4 重組腺病毒顆粒感染能力檢測 取上清液感染融合度達(dá)70% －90%的AD293細(xì)胞，用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。觀察紅色熒光蛋白表達(dá)及細(xì)胞病變情況，檢測重組病毒顆粒是否具有感染活性。

2.5 重組腺病毒的滴度測定 按Quantum公司提供的試劑盒說明書步驟，采用組織培養(yǎng)半數(shù)感染劑量(median tissue culture infectious dose，TCID50)法滴定重組腺病毒載體AdH5'.040.CMV.RFP－N的生物活性及滴度。

2.6 腺病毒載體體外感染腫瘤細(xì)胞 將人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和乳腺癌細(xì)胞系MDA－MB－231按照5×104cells/well接種于 24 孔板中，24 h后將腺病毒 AdH5'.040.CMV.RFP－N和對照病毒AdH5.CMV.EGFP按照1 000 vp/cell的劑量感染接種的細(xì)胞，37℃、5%CO2培養(yǎng)，48 h后于倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞感染效果并照相。10×物鏡下隨機(jī)選擇3個(gè)不同視野，計(jì)算RFP和EGFP陽性細(xì)胞數(shù)及總細(xì)胞數(shù)，比較上述2種腺病毒對這2種腫瘤細(xì)胞的感染效率。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。單變量配對資料之間的比較采用配對樣本t檢驗(yàn)。

結(jié) 果

1 重組腺病毒穿梭質(zhì)粒pShuttle－TurboRFP－N的酶切鑒定

腺病毒穿梭質(zhì)粒pShuttle－TurboRFP－N用核酸內(nèi)切酶Nco I、Not I雙酶切后，經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果可見3 817 bp和1 071 bp 2個(gè)片段，證明RFP基因成功克隆入腺病毒穿梭質(zhì)粒pShuttle，見圖1。

Figure 1.Identification of the vector pShuttle－TurboRFP－N.M:marker;Lane 1:the result of pShuttle－TurboRFP－N digested with Nco I and Not I.圖1 質(zhì)粒pShuttle－TurboRFP－N酶切鑒定

2 重組腺病毒載體AdH5'.040.CMV.RFP－N酶切鑒定結(jié)果

挑取無綠色熒光克隆進(jìn)行質(zhì)粒小量提取，經(jīng)過BstXⅠ和EcoRⅠ酶切鑒定正確。EcoRⅠ酶切可見1 079 bp目的基因片段，證明成功地構(gòu)建了重組腺病毒載體AdH5'.040.CMV.RFP－N，見圖2。

3 重組病毒載體在AD293細(xì)胞中的包裝和擴(kuò)增

脂質(zhì)體介導(dǎo)線性化重組腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染AD293細(xì)胞，于轉(zhuǎn)染第2 d熒光顯微鏡下觀察可見有RFP表達(dá)，轉(zhuǎn)染后第10 d出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變。表現(xiàn)為明顯增大呈球形，細(xì)胞核變大、變圓、貼壁能力下降而易脫落。用AdH5'.040.CMV.RFP－N細(xì)胞裂解液感染AD293細(xì)胞，感染第2 d即可見明顯的細(xì)胞病變及RFP表達(dá)，到第7 d出現(xiàn)明顯病毒噬斑，說明在AD293細(xì)胞中成功包裝并擴(kuò)增出具有感染性的病毒顆粒，見圖3。

Figure 2.Identification of the recombinant adenovirus vector AdH5'.040.CMV.RFP － N.M:marker;Lane 1:AdH5'.040.CMV.RFP － N was digested with EcoRⅠ;Lane 2:AdH5'.040.CMV.RFP － N was digested with BstXⅠ.圖2 重組腺病毒載體AdH5'.040.CMV.RFP－N酶切鑒定

Figure 3.Infection of AD293 cells by the recombinant adenovirus AdH5'.040.CMV.RFP － N.A:AD293 cells;B:AD293 cells infected by primary supernatant of recombinant adenovirus AdH5'.040.CMV.RFP － N after cultured for 24 h(inverted fluorescence microscope，×200).圖3 AdH5'.040.CMV.RFP －N 感染 AD293 細(xì)胞

4 重組腺病毒的滴度測定

擴(kuò)增純化后對獲得的重組腺病毒載體采用TCID50法滴定重組腺病毒載體 AdH5'.040.CMV.RFP－N，其滴度為 1×1013pfu/L。重組腺病毒顆粒數(shù)為3.6×1015vp/L。

5 腺病毒體外感染腫瘤細(xì)胞

用腺病毒 AdH5'.040.CMV.RFP － N(1 000 vp/cell)和對照病毒AdH5.CMV.EGFP感染人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和乳腺癌細(xì)胞系MDA－MB－231，48 h后于倒置熒光顯微鏡下照相，10×物鏡下隨機(jī)選取3個(gè)不同視野，通過計(jì)算RFP和EGFP陽性率來比較2種腺病毒對上述腫瘤細(xì)胞系的感染效果，見圖4。經(jīng)SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析表明:在CAR受體高表達(dá)的人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549中，腺病毒AdH5'.040.CMV.RFP－N對其感染效率(80.00%±2.65%)高于對照腺病毒(59.00% ±3.61%)，見圖4A、B，P＜0.05。在 CAR低表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞系 MDA－MB－231中，腺病毒 AdH5'.040.CMV.RFP－N對其感染效率(76.00% ±2.65%)高于對照腺病毒(51.00% ±1.73%)，見圖4C、D，P ＜0.05 。

Figure 4.Comparison of infection efficiencies between AdH5'.040.CMV.RFP － N and AdH5.CMV.EGFP.A:A549 cells infected by AdH5'.040.CMV.RFP － N;B:A549 cells infected by AdH5.CMV.EGFP;C:MDA － MB －231 cells infected by AdH5'.040.CMV.RFP－N;D:MDA－MB－231cells infected by AdH5.CMV.EGFP.圖4 腺病毒 AdH5'.040.CMV.RFP－N 和對照病毒AdH5.CMV.EGFP對腫瘤細(xì)胞感染效率的比較

討 論

腺病毒感染滴度高、既可以感染分裂期細(xì)胞又可以感染非分裂期細(xì)胞、基因容量較大、外源基因表達(dá)水平高且蛋白質(zhì)磷酸化和糖基化水平高，病毒基因組較少發(fā)生重排以及具有多種型別可供選擇等優(yōu)點(diǎn)，因此是目前基因研究普遍應(yīng)用的載體[4－6]。隨著分子生物學(xué)領(lǐng)域的迅猛發(fā)展，特別是重組DNA技術(shù)的建立，使得導(dǎo)入各種目的基因成為可能。本研究使用的pShuttle用于克隆目的基因，該穿梭質(zhì)粒含有極罕見的2種內(nèi)切酶酶切位點(diǎn) PI－SceⅠ和 I－CeuⅠ，分別位于CMV啟動子上游和PolyA尾下游，而且二者之間含有很多的克隆位點(diǎn)，可以方便地插入各種PCR產(chǎn)物或酶切產(chǎn)物。構(gòu)建重組腺病毒時(shí)，只需將插入了外源基因的穿梭質(zhì)粒用PI－SceⅠ/I－CeuⅠ雙酶切后與經(jīng)過同樣酶切的腺病毒骨架質(zhì)粒DNA連接，由于骨架質(zhì)粒分子量較大，使其連接效率較低，這是技術(shù)上的難點(diǎn)。采用體外酶切連接的方法構(gòu)建和制備表達(dá)RFP的重組腺病毒載體，比傳統(tǒng)的細(xì)胞內(nèi)同源重組方法[7]更為方便快捷，可使構(gòu)建階段最快1周完成，包括包裝出重組病毒顆粒也只需3周時(shí)間，極大地縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間，為快速高效地構(gòu)建攜帶各種目的基因的重組腺病毒載體奠定了基礎(chǔ)。

在基因治療的研究中，評價(jià)重組腺病毒的基因轉(zhuǎn)移效率、組織分布特點(diǎn)等，一般通過如 β－半乳糖苷酶基因(LacZ)、GFP基因等報(bào)告基因來進(jìn)行檢測和評價(jià)。目前，RFP的使用還遠(yuǎn)沒有GFP廣泛，與GFP相比RFP有如下優(yōu)點(diǎn)[8－10]:(1)激發(fā)和發(fā)射波長較長，具有較高的信噪比，更易檢測;(2)熒光的強(qiáng)度要比GFP的強(qiáng)度高得多;(3)對pH值不敏感，pH值為4.5－12.0時(shí)仍保持穩(wěn)定。相信隨著對RFP研究的深入，其使用范圍會更加廣泛，將成為人們進(jìn)行科學(xué)研究的重要工具。

本研究采用體外連接法成功地構(gòu)建了攜帶RFP基因的重組腺病毒載體AdH5'.040.CMV.RFP－N，將其轉(zhuǎn)染AD293細(xì)胞后包裝出重組腺病毒顆粒，感染AD293細(xì)胞后RFP得到了高效表達(dá)。在CAR受體高表達(dá)的人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549以及在CAR低表達(dá)MDA－MB－231腫瘤細(xì)胞系中，本研究所構(gòu)建的重組腺病毒AdH5'.040.CMV.RFP－N對上述2種腫瘤細(xì)胞的感染效率均高于對照腺病毒AdH5.CMV.EGFP，其原因可能是RFP的熒光的強(qiáng)度要比GFP的強(qiáng)度高得多。上述研究結(jié)果表明RFP對GFP是一種很好的代替和補(bǔ)充，為RFP作為報(bào)告基因在基因治療中的應(yīng)用奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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