劉瑞霞， 郭 兵， 王圓圓， 肖 瑛， 石明雋， 張國忠

(貴陽醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，貴州貴陽550004)

我們前期研究發(fā)現(xiàn)，核轉(zhuǎn)錄共抑制因子SnoN(Ski－related novel protein N)在糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)腎小管－間質(zhì)纖維化發(fā)病過程中可能起著重要作用[1－3]。但在 DN 發(fā)病中，有關(guān)SnoN與腎小管－間質(zhì)纖維化之間存在怎樣的關(guān)系，與腎小管－間質(zhì)纖維化的哪些成份有關(guān)，國內(nèi)外尚未檢索到相關(guān)的報(bào)道。纖維連接蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)是細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的主要成份，而ECM的過度沉積是DN腎小管－間質(zhì)纖維化的基本病理改變。因此，我們通過動(dòng)態(tài)觀察SnoN和FN在高糖培養(yǎng)大鼠原代腎小管上皮細(xì)胞(renal tubular epithelial cells，RTECs)中的表達(dá)變化;并通過siRNA技術(shù)敲低腎小管上皮細(xì)胞中SnoN的表達(dá)，再觀察FN的表達(dá)情況，初步探討SnoN與DN腎小管－間質(zhì)纖維化發(fā)病的關(guān)系。

材料和方法

1 材料

1.1 主要試劑 低糖DMEM培養(yǎng)基和胰蛋白酶(HyClone);胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)(Gibco);轉(zhuǎn)鐵蛋白(Sigma);抗 SnoN、SnoN siRNA、siRNA transfection reagent、fluorescein － conjugated control siRNA、siRNA transfection medium、siRNA dilution buffer、SnoA/N(m)－PR和抗上皮性鈣黏蛋白(E－cadherin)(Santa Cruz);抗角蛋白－18(cytokeratin－18，CK－18)、抗 α－平滑肌肌動(dòng)蛋白(α－smooth muscle actin，α －SMA)、抗 FN、抗 β －actin、DAB、濃縮型SABC－FITC免疫檢測(cè)試劑盒、生物素標(biāo)記羊抗兔IgG和生物素標(biāo)記羊抗小鼠IgG(博士德);總RNA提取試劑盒、蛋白質(zhì)marker、2×Taq PCR Master Mix和600 bp DNA marker(天根);PVDF膜和3 mm Whatman濾紙(Millipore);RevertAidTMFirst Strand cDNA SynthesisKit(Fermentas);ECL顯色劑(Pierce)。

1.2 動(dòng)物 雄性 Sprague－Dawley(SD)大鼠，清潔級(jí)，鼠齡20 d，由貴陽醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

2 方法

2.1 大鼠原代RTECs培養(yǎng) SD大鼠股動(dòng)脈放血處死后無菌取腎，分離、剪碎腎皮質(zhì)，80目、100目網(wǎng)篩分離腎小管節(jié)段;加入0.25% 胰蛋白酶，37℃水浴消化25 min;不含血清的培養(yǎng)基終止消化，生理鹽水洗3次，離心棄上清;加入含有10%FBS的低糖DMEM培養(yǎng)液，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，置37℃、5%CO2孵育箱培養(yǎng)。72 h后全量更換培養(yǎng)液，生長近融合時(shí)以1∶2傳代，經(jīng)鑒定為RTECs后繼續(xù)培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)采用第3代細(xì)胞。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組 細(xì)胞生長融合至約90%時(shí)，換無血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞生長同步。將細(xì)胞分為(1)對(duì)照組:DMEM+2%FBS培養(yǎng);(2)高滲組:19.5 mmol/L D－mannitol+DMEM+2%FBS培養(yǎng);(3)高糖組:19.5 mmol/L D－glucose+DMEM+2%FBS 培養(yǎng);每組設(shè) 30 min、2 h、12 h、24 h、48 h、72 h和96 h 7個(gè)時(shí)點(diǎn)進(jìn)行觀察。

2.3 siRNA轉(zhuǎn)染及分組 第3代腎小管上皮細(xì)胞按2×108/L濃度接種于含10%FBS、無抗生素的低糖DMEM培養(yǎng)液的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，使得在轉(zhuǎn)染當(dāng)天細(xì)胞達(dá)到60% －80%融合;分為:(1)對(duì)照組:DMEM(含糖5.5 mmol/L)+2%FBS培養(yǎng);(2)高糖組:19.5 mmol/L D－glucose+DMEM+2%FBS培養(yǎng);(3)control siRNA組:轉(zhuǎn)染 control siRNA，24 h后換為19.5 mmol/L D－glucose+DMEM+2%FBS培養(yǎng);(4)SnoN siRNA組:轉(zhuǎn)染SnoN siRNA，24 h后換為19.5 mmol/L D－glucose+DMEM+2%FBS培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染步驟按試劑盒操作說明進(jìn)行，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

2.4 免疫熒光和免疫細(xì)胞化學(xué) 細(xì)胞爬片經(jīng)4%多聚甲醛固定，0.5%Triton X－100打孔，3%H2O2去除內(nèi)源性過氧化物酶，血清封閉后，分別加入抗CK－18(1∶100)，E － cadherin(1∶200)，F(xiàn)N(1∶50)和SnoN(1∶300)抗體，4℃孵育過夜。免疫熒光細(xì)胞化學(xué)加入生物素化Ⅱ抗(1∶100)，37℃孵育40 min;滴加 SABC －FITCⅢ抗(1∶100)，37 ℃孵育30 min，LEICA DMLS熒光顯微鏡觀察并采集圖像。免疫細(xì)胞化學(xué)加入生物素化Ⅱ抗(即用型)，室溫下孵育40 min;滴DAB顯色。PBS代替Ⅰ抗，作陰性對(duì)照。

2.5 Western blotting 加裂解液裂解細(xì)胞，離心取上清，BCA法測(cè)蛋白濃度。加樣緩沖液變性蛋白，上樣，經(jīng)SDS－PAGE垂直凝膠電泳后，電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯 (polyvinylidene difuoride，PVDF)膜。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，含0.05%Tween 20的TBS(TBST)沖洗后，用特異性抗體進(jìn)行孵育，Ⅰ抗?jié)舛热缦?SnoN(1∶400)、FN(1∶100)、CK －18(1∶200)、E －cadherin(1∶200)、α － SMA(1∶100)和 β － actin(1∶400);4℃過夜。經(jīng)TBST沖洗后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗，室溫孵育90 min。TBST沖洗，ECL顯影曝光，Bio－Rad凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行圖像采集，Quantity One 4.6軟件分析各陽性條帶的積分灰度值，設(shè)內(nèi)參照β－actin，計(jì)算各目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2.6 RT－PCR 采用Trizol試劑盒提取細(xì)胞RNA，瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA的完整性，核酸蛋白儀測(cè)定RNA的濃度和純度。取3 μg逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)行半定量PCR反應(yīng)。PCR引物序列:SnoN(500 bp)上游引物5’－GAAAACCTCCAGTCTAAGTTCTCCTTAGTT－3'，下游引物 5’－ATGAAGCTGGTCTGAAGTACACCTTGAACA－3';相應(yīng) β－actin(306 bp)上游引物 5'－TGGCATTGTGATGGACTC －3'，下游引物 5'－CCGATAGTGATGACCTGAC－3'。FN(255 bp)上游引物 5'－GGACACTATGCGGGTCACTT－3'，下游引物 5'－TCAAAACCAGTTGGGGAGTC －3';相應(yīng)β－actin(490 bp)上游引物5'－GAAATCGTGCGTGACATTAAG －3'，下游引物 5'－CTAGAAGCATTTGCGGTGGA－3'。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，Bio－Rad凝膠成像系統(tǒng)掃描，Quantity One 4.6軟件分析各條帶積分吸光度值，mRNA的相對(duì)表達(dá)量用目標(biāo)mRNA/β－actin的積分吸光度值表示。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 大鼠原代RTECs的鑒定

倒置顯微鏡下可見，體外培養(yǎng)的原代RTECs長勢(shì)良好，第3 d即形成明顯集落，形態(tài)呈典型的多邊鵝卵石樣，見圖1。用上皮細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白E－cadherin和CK－18及間質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白α－SMA對(duì)實(shí)驗(yàn)所用3代細(xì)胞進(jìn)行鑒定。免疫熒光和Western blotting結(jié)果均顯示，3代細(xì)胞E－cadherin和CK－18蛋白表達(dá)陽性，見圖2，且?guī)缀蹩床坏溅粒璖MA蛋白表達(dá)，見圖3，說明培養(yǎng)細(xì)胞為大鼠原代RTECs。

Figure 1.The third day of primary culture(×400).圖1 原代培養(yǎng)第3 d

Figure 2.Expressions of E －cadherin and CK －18 in primary cultured RTECs(SABC，×400).NC:negative control.圖2 E－cadherin和CK－18在原代培養(yǎng)RTECs中的表達(dá)

Figure 3.Expressions of E －cadherin，CK －18 and α －SMA in primary cultured RTECs.圖3 E－cadherin、CK－18和α－SMA在原代培養(yǎng)RTECs中的表達(dá)

2 不同處理組RTECs中SnoN蛋白表達(dá)

用高糖及甘露醇刺激大鼠原代RTECs 30 min－96 h，免疫熒光細(xì)胞化學(xué)和Western blotting檢測(cè)SnoN蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示，RTECs胞漿和胞核均有SnoN表達(dá)，見圖4;高糖刺激2 h SnoN蛋白表達(dá)減少(P＜0.05)，且呈時(shí)間依賴性;甘露醇刺激72 h出現(xiàn)SnoN蛋白表達(dá)減少，但仍顯著高于高糖組(P＜0.01)，見圖5。

3 FN蛋白和mRNA在不同處理組RTECs中的表達(dá)

免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示，F(xiàn)N蛋白在RTECs中主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，見圖6。

Western blotting結(jié)果表明，與正常糖對(duì)照組相比，高糖培養(yǎng)原代RTECs 30 min FN蛋白表達(dá)即顯著增多，持續(xù)至高糖培養(yǎng)96 h;高滲培養(yǎng)12 h出現(xiàn)FN蛋白表達(dá)增多，但仍顯著低于高糖組，見圖7。

Figure 4.Expression of SnoN protein in primary cultured RTECs after incubated with normal－glucose，mannitol and high－glucose medium(SABC，×400).NC:negative control;C:control;MO:mannitol;HG:high glucose.圖4 不同條件培養(yǎng)原代RTECs中SnoN蛋白表達(dá)

Figure 5.Expression of SnoN protein in primary cultured RTECs after incubated with normal－glucose，mannitol and high－glucose medium at different time points.*P ＜ 0.05，＊＊P ＜0.01 vs control;##P ＜0.01 vs mannitol.圖5 SnoN蛋白在不同處理組原代RTECs中的表達(dá)

Figure 6.Expression of FN protein in primary cultured RTECs after incubated with different conditions(SABC，×400).NC:negative control;C:control;MO:mannitol;HG:high glucose.圖6 不同條件培養(yǎng)原代RTECs中FN蛋白表達(dá)

RT－PCR結(jié)果顯示:高糖培養(yǎng)原代RTECs 30 min即能促進(jìn)FN mRNA表達(dá)，并隨高糖培養(yǎng)時(shí)間延長，F(xiàn)N mRNA表達(dá)持續(xù)增多;高滲處理2 h出現(xiàn)FN mRNA表達(dá)增多，但從24 h起各時(shí)點(diǎn)仍顯著少于高糖培養(yǎng)組，見圖8。

Figure 7.Expression of FN protein in primary cultured RTECs after incubated with normal－glucose，mannitol and high－glucose medium at different time points.＊＊P ＜ 0.01 vs control;##P ＜0.01 vs mannitol.圖7 FN蛋白在不同處理組原代RTECs中的表達(dá)

Figure 8.Expression of FN mRNA in primary cultured RTECs after incubated with normal－glucose，mannitol and high－glucose medium at different time points.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs mannitol.圖8 FN mRNA在不同處理組原代RTECs中的表達(dá)

4 siRNA 轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)

轉(zhuǎn)染綠色熒光標(biāo)記control siRNA的腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)可見綠色熒光表達(dá)，并位于細(xì)胞核位置，提示siRNA已轉(zhuǎn)染至細(xì)胞內(nèi)，見圖9。

RTECs轉(zhuǎn)染 control siRNA和 SnoN siRNA后，control siRNA轉(zhuǎn)染組SnoN蛋白和mRNA與未轉(zhuǎn)染RTECs相比差異無顯著;與未轉(zhuǎn)染 RTECs相比，SnoN siRNA轉(zhuǎn)染組SnoN蛋白和mRNA水平分別下降48.63%和54.41%，見圖10。

5 轉(zhuǎn)染SnoN siRNA對(duì)高糖培養(yǎng)RTECs SnoN蛋白表達(dá)的影響

RTECs成功轉(zhuǎn)染SnoN siRNA后給予高糖條件培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)30 min、2 h、12 h、24 h 和 48 h 收集細(xì)胞蛋白，Western blotting檢測(cè)各時(shí)點(diǎn)SnoN蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，隨高糖培養(yǎng)時(shí)間延長SnoN蛋白表達(dá)減少，至48 h時(shí)幾乎檢測(cè)不到SnoN蛋白表達(dá)，見圖11。

Figure 9.Fluorescein－conjugated control siRNA was used to transfect the primary cultured RTECs.圖9 轉(zhuǎn)染fluorescein conjugated control siRNA的原代RTECs

Figure 10.The protein(A)and mRNA(B)levels of SnoN in RTECs transfected by SnoN siRNA.±s.n=3.＊＊P＜0.01 vs control.圖10 腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染SnoN siRNA后SnoN蛋白(A)和mRNA(B)表達(dá)水平

Figure 11.Expression of SnoN protein in RTECs transfected by SnoN siRNA as incubated with high glucose.±s.n=3.＊＊P ＜0.01 vs control group.圖11 高糖培養(yǎng)轉(zhuǎn)染SnoN siRNA RTECs中SnoN蛋白的表達(dá)

6 SnoN siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)高糖培養(yǎng)RTECs FN蛋白表達(dá)的影響

Western blotting結(jié)果表明，高糖顯著上調(diào)RTECs中FN蛋白表達(dá)，轉(zhuǎn)染SnoN siRNA后高糖誘導(dǎo)的FN蛋白表達(dá)進(jìn)一步增多，與單純高糖培養(yǎng)相比增加68.53%，見圖12。

討 論

Figure 12.Expression of FN protein in RTECs transfected by SnoN siRNA as incubated with high glucose.±s.n=3.＊＊P ＜ 0.01 vs control;#P ＜ 0.05 vs high glucose.圖12 高糖培養(yǎng)轉(zhuǎn)染SnoN siRNA RTECs中FN蛋白的表達(dá)

隨著對(duì)腎間質(zhì)纖維化機(jī)制研究的加深，RTECs在其中的作用日益被重視。目前已證明，RTECs的轉(zhuǎn)分化、增生及凋亡等均參與了腎間質(zhì)纖維化過程。因此，研究RTECs形態(tài)和功能的異常變化，對(duì)闡明腎間質(zhì)纖維化發(fā)病機(jī)制有重要作用。當(dāng)前，國內(nèi)外對(duì)于RTECs的研究大多采用細(xì)胞株，但進(jìn)行生物學(xué)研究時(shí)，原代培養(yǎng)的RTECs更能反應(yīng)其在體內(nèi)的生長特性。本研究參考國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道[4，5]，并在本課題組前期培養(yǎng)基礎(chǔ)上加以改進(jìn)，原代細(xì)胞呈明顯的上皮細(xì)胞生長特性，E－cadherin和CK－18蛋白表達(dá)陽性，且未見 α－SMA蛋白表達(dá)，表明大鼠原代RTECs培養(yǎng)成功。

我們用高糖處理原代培養(yǎng)的RTECs，并用相同濃度的甘露醇作為對(duì)照，以排除滲透壓的影響。動(dòng)態(tài)觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SnoN和FN蛋白均有表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞，與正常糖對(duì)照組相比，高糖培養(yǎng)2 h起腎小管上皮細(xì)胞中SnoN蛋白表達(dá)開始減少，且呈時(shí)間依賴性，至96h時(shí)只有少量表達(dá)。我們的體外研究還發(fā)現(xiàn)，高糖在降低SnoN蛋白表達(dá)的同時(shí)能促進(jìn)FN蛋白和mRNA表達(dá)，且對(duì)SnoN蛋白和FN表達(dá)的影響顯著高于滲透壓對(duì)照組。以上結(jié)果提示，高糖是引起RTECs SnoN蛋白表達(dá)減少的主要原因;隨著SnoN蛋白表達(dá)減少，RTECs中FN蛋白和mRNA表達(dá)增加。

有關(guān)SnoN的研究，目前多集中于其與腫瘤發(fā)生的關(guān)系上[6－9]，Yang 等[10]研究報(bào)道 SnoN 蛋白表達(dá)減少在單側(cè)輸尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction，UUO)所致腎纖維化的發(fā)生中起重要作用。我們前期的研究結(jié)果提示，SnoN蛋白表達(dá)減少在糖尿病大鼠腎小管－間質(zhì)纖維化發(fā)病過程中可能起著重要作用[1－3]。但無論是在UUO還是DN腎纖維化發(fā)病過程中，SnoN蛋白表達(dá)減少是通過那些途徑引起腎小管－間質(zhì)纖維化的，以及其與腎間質(zhì)纖維化的那些成份有關(guān)，目前仍不甚清楚。

本實(shí)驗(yàn)中用fluorescein conjugated control siRNA作為對(duì)照，通過熒光顯微鏡觀察到綠色熒光主要分布于細(xì)胞核及核周區(qū)，初步推斷SnoN siRNA導(dǎo)入細(xì)胞，并進(jìn)入了細(xì)胞核。但進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的SnoN siRNA是否對(duì)SnoN基因有抑制作用，還需對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。本研究通過RT－PCR和Western blotting進(jìn)行檢測(cè)，顯示轉(zhuǎn)染 SnoN siRNA的 RTECs與正常RTECs相比，SnoN mRNA和蛋白的表達(dá)分別下降54.41%和48.63%，而轉(zhuǎn)染 control siRNA不影響RTECs SnoN mRNA和蛋白表達(dá)，說明本實(shí)驗(yàn)siRNA技術(shù)對(duì)SnoN基因表達(dá)抑制的有效性。

用高糖培養(yǎng)轉(zhuǎn)染SnoN siRNA的原代RTECs，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨培養(yǎng)時(shí)間延長SnoN蛋白表達(dá)減少，至高糖培養(yǎng)48h時(shí)幾乎檢測(cè)不到SnoN蛋白表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)了高糖能抑制RTECs SnoN蛋白表達(dá)。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，隨糖尿病大鼠腎組織中SnoN蛋白表達(dá)減少，對(duì)致纖維化細(xì)胞因子轉(zhuǎn)化生長因子－β1的抑制作用減弱，F(xiàn)N蛋白表達(dá)增加，細(xì)胞基質(zhì)沉積增多，腎小管－間質(zhì)纖維化病變加重[2]。但在DN發(fā)生發(fā)展中SnoN是否參與了FN表達(dá)的調(diào)控，以及SnoN表達(dá)減少在腎小管－間質(zhì)纖維化發(fā)生發(fā)展中的作用是否與FN有關(guān)，尚不清楚。本次實(shí)驗(yàn)顯示，與單純高糖培養(yǎng)組相比，高糖誘導(dǎo)的腎小管FN的表達(dá)在SnoN siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞中顯著增多。這些結(jié)果說明SnoN表達(dá)減少參與了高糖誘導(dǎo)的RTECs中FN合成過程，SnoN表達(dá)下調(diào)所引起的DN腎小管－間質(zhì)纖維化與RTECs中FN的表達(dá)增多有關(guān)。

由于腎小管－間質(zhì)纖維化的嚴(yán)重性與DN預(yù)后密切相關(guān)，但DN發(fā)病機(jī)制至今尚未完全闡明，且缺乏有效的治療措施。而本研究發(fā)現(xiàn)SnoN蛋白表達(dá)減少參與了高糖環(huán)境下腎小管－間質(zhì)纖維化主要成份FN的合成過程，將有助于進(jìn)一步闡明DN的發(fā)病機(jī)制，并為藥物開發(fā)提供新的靶點(diǎn)。

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