Wnt-1和PAR-1在胃癌中的表達及其病理特征的相關(guān)性研究

劉燦均,蔡圣強,車彥軍

(江蘇省靖江市人民醫(yī)院外科,江蘇靖江,214500)

胃癌是最常見的癌腫之一,占我國消化道腫瘤的第一位。近年來的研究表明,Wnt-1信號傳導(dǎo)途徑的不恰當激活參與多種人類腫瘤的發(fā)病而蛋白激活酶受體-1(Proteinase-Activated Receptor-1 PAR-1)基因可能是與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因[1-2]。因此Wnt-1和PAR-1在胃癌中的基因表達以及與胃癌的病理特征3者間是否有相關(guān)性,目前國內(nèi)文獻尚無報道。本研究采用免疫組化的方法檢測胃癌及正常胃組織中Wnt-1和PAR-1的基因表達,研討2者在胃癌組織中表達的相關(guān)性,以及與胃癌病理特征之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集本院2008年1月～2010年12月的胃癌根治術(shù)切除病例的、經(jīng)10%甲醛固定的石蠟包埋的胃癌組織標本78例,其中男51例,女27例;年齡39～83歲,平均58.3歲。所有納入研究對象的病例均接受胃癌根治術(shù),術(shù)前均未行放、化療和生物免疫治療。根據(jù)入選病例的性別、年齡、腫瘤的大小、腫瘤分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況以及TNM分期等病理特點進行分組,其中年齡分為<60歲組和≥60歲組,按腫瘤大小分為腫瘤直徑<5 cm組和腫瘤直徑≥5 cm組,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況按目的蛋白表達陽性與否分為2組,其余病理特征均按等級進行分組。同時對其中50例患者的癌旁正常胃組織作為正常對照。

1.2 試劑

Wnt-1山羊抗人多克隆抗體購自Santa Cruz公司;PAR-1兔抗人多克隆抗體購自英國abcom公司;一抗工作液濃度均為1:100。二抗的山羊SP試劑盒和兔SP試劑盒均購自北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 免疫組化染色

將入選病例的手術(shù)標本和正常對照標本經(jīng)石蠟包埋后,4 μ m后的切片貼于載玻片上,經(jīng)二甲苯和梯度乙醇脫蠟至水,PBS洗3次,3 min/次;熱修復(fù)抗原后室溫冷卻,PBS洗5 min后,在過氧化氫甲醇溶液中浸泡30 min,以抑制內(nèi)源性過氧化物酶的活性;然后PBS洗3次,3min/次;滴加正常的山羊血清封閉液室溫下20 min,甩去多余液體,滴加一抗4℃過夜。37℃下復(fù)溫45 min,PBS洗3次,3 min/次,加生物素化二抗,室溫下30 min;DAB顯色,自來水洗滌后核蘇木素復(fù)染,脫水,透明樹膠封片。以PBS替代一抗行陰性對照。陽性片一抗體說明書自帶的陽性結(jié)果作為參照。

1.4 結(jié)果判定

Wnt-1異常表達于細胞質(zhì)中;PAR-1表達于細胞質(zhì)和細胞膜上。采用二級計分法來評估免疫組化的染色效果,首先按染色強度評分:無色為0分,淡黃色為1分,棕黃色為2分,棕褐色為3分;然后按陽性細胞率評分:細胞內(nèi)無陽性染色者或陽性細胞率<10%者為0分,陽性細胞率10%～25%者為1分,陽性細胞率25%～50%者為2分,陽性細胞率50%～75%者為3分,陽性細胞率>75%者為4分。將每張片子的的隨機的5個視野中2者評分結(jié)果相加的平均值得到的即為免疫組化評分。陽性結(jié)果判斷:≤3分者為陰性(-),>3分者為陽性(+)。

2 結(jié) 果

2.1 Wnt-1和PAR-1在胃癌原發(fā)灶和正常為組織的表達

Wnt-1異常表達于細胞質(zhì)中;PAR-1表達于細胞質(zhì)和細胞膜上,2者在胃癌組織中的陽性表達率明顯高于正常胃組織(P<0.05),有顯著統(tǒng)計學意義,見表1。

表1 Wnt-1和PAR-1在胃癌原發(fā)灶和正常為組織的表達

2.2 Wnt-1和PAR-1的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系

分別將Wnt-1和PAR-1表達陽性與否分為2組:即目的蛋白表達陽性組和目的蛋白表達陰性組,觀察每組病例的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況分為 N0、N1、N2、N3。采用 Wilcoxon 秩和檢驗進行統(tǒng)計學處理,結(jié)果顯示:Wnt-1表達陽性組和Wnt-1蛋白表達陰性組相比較,有顯著統(tǒng)計學意義,從數(shù)據(jù)中可以看出,Wnt-1表達陽性組具有更高的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率;同樣的,PAR-1表達陽性組和PAR-1蛋白表達陰性組相比較,PAR-1表達陽性組具有更高的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率(P<0.01),見表2。

表2 Wnt-1和PAR-1的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系

2.3 Wnt-1和PAR-1的表達與病理特征的關(guān)系

本研究中,將患者分別按性別、年齡、腫瘤的大小、腫瘤分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況以及TNM分期等病理特點進行分組,根據(jù)免疫組化染色情況分別進行χ2檢驗,結(jié)果顯示:Wnt-1和PAR-1的表達與患者的性別和年齡無關(guān),與腫瘤的大小、腫瘤分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況以及TNM分期密切相關(guān)(P<0.05),見表3。從表中數(shù)據(jù)可以看出,腫瘤越大、腫瘤分化程度越低、浸潤深度越深、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率越高以及TNM分期越晚Wnt-1和PAR-1的表達率也越高。

表3 Wnt-1和PAR-1的表達與病理特征的關(guān)系

2.4 Wnt-1和PAR-1在胃癌中的表達的相關(guān)性研究

為了更好地分析Wnt-1和PAR-1二者在胃癌中表達的相關(guān)性,本研究經(jīng)免疫組化染色評分結(jié)果分為4個等級,即0～1分、2～3分、4～5分和6～7分,各等級中Wnt-1和PAR-1的表達情況即構(gòu)成比見表4;各構(gòu)成比采用Spearman相關(guān)分析進行統(tǒng)計學處理,結(jié)果顯示呈現(xiàn)出正相關(guān)關(guān)系。

表4 Wnt-1和PAR-1在胃癌中的表達的相關(guān)性

3 討 論

Wnt基因于1982年發(fā)現(xiàn),與小鼠乳腺癌,最初被命名為NT-1,后發(fā)現(xiàn)與果蠅的無翅基因wingless(wg)高度同源,因此被命名為Wnt基因。Wnt蛋白是一種由Wnt基因編碼的分泌糖蛋白,分泌后與細胞表面基質(zhì)及其特異性受體卷曲蛋白(Fz)相互作用,通過其下游散亂蛋白(DSH)、GSK23β 、β2catenin 、APC 等磷酸化和去磷酸化過程來完成Wnt信號傳遞,組成Wnt途徑。Wnt通路是一種對細胞增殖和分化具有重要調(diào)節(jié)作用的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng),是一個由多種分子參與、相互影響、相互制約的復(fù)雜體系。近年來發(fā)現(xiàn)很多腫瘤發(fā)生與Wnt信號異常相關(guān),在胃癌的發(fā)生發(fā)展中也不乏Wnt信號通路異常的報道[3]。

本研究發(fā)現(xiàn)Wnt-1在胃癌組織中有表達,在正常胃黏膜組織中無表達,與正常組織相比,差異具有統(tǒng)計學意義。這本實驗研究發(fā)現(xiàn),Wnt-1與癌組織的分化高低有關(guān),高分化組織中表達低于低分化組織,與Jnsson等[4]在乳腺癌組織中研究的結(jié)果高分化者表達高,低分化者表達較少相反。Jnsson等對乳腺癌進行的相關(guān)研究表明,Wnt表達丟失可能是一個獨立于淋巴結(jié)狀態(tài)和腫瘤大小的,有用的預(yù)測復(fù)發(fā)的標志物,Wnt的丟失增加乳腺浸潤性導(dǎo)管癌的早期復(fù)發(fā)和死亡的風險,他們提出,Wnt蛋白在乳腺發(fā)揮腫瘤抑制作用。目前認為不同腫瘤中Wnt的作用機制可能存在差異[5]。本實驗研究還發(fā)現(xiàn)Wnt-1在胃癌組織中表達水平與腫瘤大小、侵入深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期有關(guān)。這與Khor等[3]結(jié)直腸癌的研究相似。這也與國外學者Katoh[6]檢測結(jié)果基本一致,Katoh在對人類癌細胞中Wnt-1的表達研究中發(fā)現(xiàn):在GCOKAJIMA細胞系和胰腺癌BxPC-3細胞系中Wnt-1 mRNA的表達量明顯升高,在原發(fā)型胃癌患者中Wnt-1mRNA的陽性表達率占50%。因此認為Wnt-1可以作為評價胃癌生物學行為較好的指標,同時也為抗癌藥物的研究提供了新靶點。

蛋白酶激活受體(PAR)又稱凝血酶受體,PAR-1是PARs家族的主要成員,是最早發(fā)現(xiàn)的PARs分子,人PAR-1基因定位于染色體5q13,含有 2個外顯子,由425個氨基酸組成,蛋白核心分子量為47 000,具有典型的G蛋白耦聯(lián)膜受體結(jié)構(gòu)特征,它介導(dǎo)凝血酶的細胞生物學效應(yīng)[7]。研究表明,PAR-1參與多種惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移等復(fù)雜生物學行為,PAR-1表達水平可能與乳腺癌骨轉(zhuǎn)移特性相關(guān)[2],與前列腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān),在黑色素瘤也是隨惡性度增加而陽性表達提高,最近研究顯示,PAR-1表達水平也與胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移等生物學特性密切相關(guān)[8]。目前國內(nèi)有關(guān)PAR-1在腫瘤中表達的研究報道還見于肺癌、宮頸癌、鼻咽癌,可見PAR-1與惡性上皮性腫瘤的惡性侵襲和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等生物學行為密切相關(guān)。

本研究結(jié)果示PAR-1的表達在胃癌組織中高于癌旁胃組織,有明顯的統(tǒng)計學意義;并且PAR-1的表達水平與腫瘤大小、侵入深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(guān)。由此可見,PAR-1在惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移等生物學行為中起著重要作用,其詳細作用機制遠未被闡明,需要進行大量的實驗室研究。本研究結(jié)果表明,Wnt-1和PAR-1在胃癌中的表達成正相關(guān),但具體的作用機制尚不清楚,我們推測,PAR-1在胃癌中的表達是否與通過激活Wnt信號途徑而發(fā)揮作用有關(guān)尚待進一步研究探索。就本研究的臨床資料和病理學檢測結(jié)果可明確,PAR-1與胃癌侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān),可以作為判斷胃癌患者預(yù)后的一個生物學指標。

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