衍生分光光度法測定麥麩粗提液中阿魏酸的含量

楊 雪，姚艷艷，張志清*

(四川農(nóng)業(yè)大學食品學院，四川 雅安 625014)

衍生分光光度法測定麥麩粗提液中阿魏酸的含量

楊 雪，姚艷艷，張志清*

(四川農(nóng)業(yè)大學食品學院，四川 雅安 625014)

目的：建立衍生分光光度法測定麥麩粗提液中阿魏酸的含量。方法：以0.6g/100mL FeCl3-0.9g/100mL K3[Fe(CN)6](1:0.9)混合溶液為顯色劑，并以顯色劑為空白，在720nm波長處測定吸光度。結(jié)果：阿魏酸在2.36～14.16μg/mL范圍內(nèi)，吸光度與阿魏酸的質(zhì)量濃度呈良好的線性關系(r=0.9996)，最小檢出量為0.022μg/mL，平均加標回收率為103.1%。結(jié)論：本檢測方法操作簡便、準確、回收率高，適用于麥麩粗提液中阿魏酸含量的測定。

麥麩；阿魏酸；衍生分光光度法

麥麩是小麥加工的主要副產(chǎn)品，通常占小麥質(zhì)量的14%～19%[1]。我國麥麩年產(chǎn)量可達2000萬噸以上[2]，但綜合利用率還不到20%，并且主要作為飼料使用，利用率和價值都很低。大量研究表明，小麥麩皮主要由一些具有明顯功能的細胞層組成[3]，不僅含有豐富的膳食纖維、蛋白質(zhì)、碳水化合物等，還含有多種酚酸，如香草酸、阿魏酸等，后者是含量最高的酚酸[4]。阿魏酸及衍生物具有抗氧化、抗血栓、降血脂、抗動脈粥樣硬化、抗菌消炎、抗突變防癌等功能特性[4]，因此在許多方面都有廣泛的用途。

目前常應用于阿魏酸測定的方法主要有高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)法、薄層色譜(thin layer chromatography，TLC)法、毛細管電泳(capillary zone eletrophoresis，CZE)、紫外(ultra violet，UV)直接測定。其中，HPLC法由于具有極強的分離能力和極高的靈敏度，因而測定準確，是進行天然產(chǎn)物精確定量最佳方法。TLC法和CZE應用時前者一般作為定性分析和半定量分析，而CZE法則需要較高的設備條件，且測定的穩(wěn)定性還有待優(yōu)化。UV直接測定法通過測定阿魏酸在特定溶劑中特定波長的吸光度進而確定阿魏酸含量，具有操作簡單、成本低廉、分析快速，但由于樣品分析時易受到其他物質(zhì)的影響，導致準確性下降，因此也有研究開始采用一些特異性的衍生反應來測定阿魏酸，但方法的穩(wěn)定性還有待優(yōu)化。

本研究前期已經(jīng)建立了一套超聲波輔助堿醇提取HPLC測定麥麩中阿魏酸含量的方法，其平均加標回收率可達97.9%，重復性實驗RSD為1.59%[5]。在研究中發(fā)現(xiàn)，該法應用于麥麩樣品檢測具有操作簡便、準確、回收率高、重復性好的優(yōu)點，但其操作復雜，成本較高。利用衍生試劑與待測有機物發(fā)生化學反應生成的有色締合物，采用分光光度法進行分析可避免其他成分或雜質(zhì)的干擾，且測定快速，可有效應用于有機物含量測定。本實驗利用阿魏酸在0.1mL鹽酸中能與鐵氰化鉀-三氯化鐵生成深綠色化合物的顯色反應[6]，同時選擇十二烷基硫酸鈉作為表面活性劑。選用上述高效液相色譜法作為對比，建立衍生分光光度法定量分析麥麩粗提液中阿魏酸含量，旨在為更加準確、快速應用于阿魏酸粗提物純化提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

阿魏酸粗提物按照文獻[7]制備；反式阿魏酸標準品(純度＞99%) 德國Sigma公司；無水乙醇、十二烷基硫酸鈉、鐵氰化鉀、三氯化鐵、鹽酸(均為分析純)，甲醇(色譜純)。

1.2 儀器與設備

UNIC7200型分光光度儀 上海優(yōu)尼科公司； SHZ-82A氣浴恒溫振蕩器 江蘇中大儀器廠；高效液相色譜儀[SPD-10A VP紫外-可見檢測器、LC-6A高壓泵、CTO-10AS VP柱溫箱(含7725i型手動進樣器)] 日本Shimadzu公司；N2000工作站 浙江大學智達信息工程有限公司；CP225D型電子天平 德國Sartorius公司；Milli-Q型純水儀 美國Millipore公司。

1.3 方法

FastEthernet0/1 128.2 128 19 FWD 0 4096 cc00.1ca0.0001 128.2

1.3.1 標準溶液的配制

精確稱取阿魏酸標準品0.1180g，用甲醇溶解并定容至50mL棕色容量瓶中，制成2.36mg/mL阿魏酸溶液。再量取1mL用無水乙醇稀釋至50mL，制得0.0472mg/mL的阿魏酸標準溶液，并置于－4℃保存。

1.3.2 顯色劑的配制

將0.6g/100mL三氯化鐵和0.9g/100mL鐵氰化鉀以1:0.9比例充分混勻，臨用前現(xiàn)配。

1.3.3 檢測波長的確定

參考多酚類物質(zhì)的檢測方法并結(jié)合實驗條件[8-10]，確定檢測的波長為720nm。

1.3.4 檢測方法

精確量取一定體積的阿魏酸樣品置于10mL棕色容量瓶中，加入無水乙醇至2mL，分別加入0.8mL 0.3g/100mL十二烷基硫酸鈉溶液(SDS)，0.4mL鐵氰化鉀-三氯化鐵顯色劑，搖勻，暗處靜置5min，用0.1mol/L鹽酸稀釋至10mL，在35℃氣浴中放置并搖勻20min。放至室溫后在720nm波長處檢測其吸光度。

2 結(jié)果與分析

精確量取阿魏酸標準溶液(0.0472mg/mL)0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL，分別置于10mL棕色容量瓶中，并加無水乙醇至2mL，再分別加入0.8mL 0.3g/100mL十二烷基硫酸鈉溶液(SDS)，0.4mL鐵氰化鉀-三氯化鐵顯色劑，搖勻，暗處靜置5min，用0.1mol/L鹽酸定容至10mL(此時阿魏酸標準品質(zhì)量濃度分別為0、2.36、4.72、7.08、9.44、11.80、14.16μg/mL)，在35℃氣浴中放置并搖勻20min。放至室溫后在720nm波長處依次測定吸光度，每點測定3次，取平均值。

以吸光度為縱坐標(Y)、阿魏酸的質(zhì)量濃度為橫坐標(X)繪制標準曲線，得到阿魏酸含量的線性回歸方程為Y= 0.0556X－0.0565(r=0.9996)。結(jié)果表明在2.36～14.16μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關系。

2.2 最小檢出量測定

按照前處理步驟配制空白溶液，連續(xù)20次測定其吸光度(表1)，計算標準差，并且計算置信水平為95%時的最小檢出量。實驗測定空白樣品的平均吸光度為0.001，此衍生分光光度法的最小檢出量0.022μg/mL。2.3 精密度實驗

表2 精密度實驗結(jié)果(n=5)Table 2 Results of precision test (n=5)

精確量取阿魏酸標準品0.3mL置于10mL棕色容量瓶中，按1.3.4節(jié)進行顯色和測定，連續(xù)5次測定其吸光度(表2)，其相對標準偏差(RSD)為2.34%(n=5)，說明具有良好的精密度。

表1 最小檢出量實驗結(jié)果Table 1 Minimum detectable amount of ferulic acid

2.4 重復性實驗

分別量取5組0.3mL同一批次阿魏酸粗提液樣品，按1.3.4節(jié)進行顯色和測定，以測得的阿魏酸吸光度為指標(表3)，測定重復性實驗阿魏酸含量的RSD為4.29%(n=5)，表明方法重復性良好，能滿足實驗要求。

表3 重復性實驗結(jié)果(n=5)Table 3 Results of reproducibility tests (n=5)

2.5 穩(wěn)定性實驗

精確量取0.3mL阿魏酸標準品置于10mL棕色容量瓶中，按1.3.4節(jié)進行顯色，并在黑暗處放置保存，分別于0、2、4h測定吸光度(表4)。RSD為3.08%，證明該方法用于麥麩粗提液阿魏酸在經(jīng)衍生處理后4h內(nèi)測定結(jié)果均穩(wěn)定。

表4 穩(wěn)定性實驗結(jié)果Table 4 Results of stability test

2.6 加標回收率實驗

表5 阿魏酸的加標回收率實驗結(jié)果Table 5 Average spike recovery rates for ferulic acid

準確量取同一批次阿魏酸粗提液0.1mL(含阿魏酸7.3409μg)于10mL棕色容量瓶中(共6份)，再分別按照V標準品:V樣品為0.8:1、1:1、1.2:1 加入阿魏酸標準品(0.0472mg/mL)，然后按檢測方法進行操作并計算其回收率(表5)。實驗表明在3個不同的添加水平下，阿魏酸測定的平均回收率分別為103.1%，RSD值為3.51%，表明該方法測定的結(jié)果比較準確。

2.7 衍生分光法與高效液相色譜法對比

本研究前期建立高效液相測定方法[5]，色譜柱采用Hyperclone BDS C18柱(150mm×4.60mm，5μm)，以甲醇:1%冰乙酸溶液=25:75為流動相，柱溫30℃，流速1.0mL/min，測定波長320nm將3種不同濃度的阿魏酸粗提液分別用衍生分光光度法和上述HPLC法進行檢測。并以樣品中所含阿魏酸質(zhì)量濃度為指標，將兩種檢測結(jié)果進行對比，結(jié)果見表6。

表6 衍生分光光度法與HPLC法檢測結(jié)果對比Table 6 Comparison of ferulic acid contents determined by derivatization combined with spectrophotometry and HPLC

由以上實驗結(jié)果可知分光光度法與高效液相色譜法的測量值相比，相對誤差在2%以內(nèi)。說明該方法測定結(jié)果與HPLC法的結(jié)果誤差小，可以用于阿魏酸粗提液純化過程的快速分析。同時通過比較HPLC方法[5]與該方法的精密度(RSD值)、穩(wěn)定性、平均回收率(表7)，前者的精密度、穩(wěn)定性、以及加標回收率等指標均優(yōu)于后者，但是衍生分光光度法具有分析成本低，檢測時間快的特點。

表7 衍生分光光度法與HPLC法對比Table 7 Comparison of determination methods between derivatization combined with spectrophotometry and HPLC

3 討 論

3.1 鐵氰化鉀-三氯化鐵反應原理為阿魏酸的酚羥基具有還原性，能將[Fe(CN)6]3-還原成[Fe(CN)6]4-，還原產(chǎn)物[Fe(CN)6]4-接著與Fe3+反應生成Fe4[Fe(CN)6]3(普魯士藍)供定量測定。而十二烷基硫酸鈉可增加溶液的表面張力，有助于顯色劑沉淀的溶解，增強顯色的穩(wěn)定性。李廣勝等[6]在測定丹參口服液中總酚酸含量時，選擇0.6g/100mL FeCl3-0.9g/100mL K3[Fe(CN)6](1:0.9)混合液作為顯色劑，制備檢測液時依次加入70%乙醇、0.3%十二烷基硫酸鈉、顯色劑和0.1mol/L鹽酸。但考慮到阿魏酸在無水乙醇和70%乙醇中的溶解度差別不大，其次無水乙醇可以直接使用而不需要配制，因此本實驗中選用無水乙醇作為溶劑。黃喜茹等[11]在用鐵氰化鉀-三氯化鐵顯色體系測定丹參及其制劑中水溶性酚酸總量時，在使用0.9g/100mL三氯化鐵溶液和0.6g/100mL鐵氰化鉀溶液按1.0:0.9配制而成的顯色劑時，在其他實驗條件固定的情況下，只改變顯色劑的加入量，配制系列測定溶液，分別測定其吸光度。結(jié)果表明，顯色劑加入量為0.4～0.5mL時吸光度最大且穩(wěn)定。而在其他條件不變時，改變十二烷基硫酸鈉的加入量，配制系列測定溶液，分別測定其吸光度。結(jié)果表明，十二烷基硫鈉溶液加入量為0.8～0.9mL時溶液顯色穩(wěn)定性最好，最后選擇用1mol/L冰醋酸作為溶劑。因此本實驗中顯色劑(0.6g/100mL FeCl3:0.9g/100mL K3[Fe(CN)6]=1:0.9)加入體積為0.4mL，十二烷基硫酸鈉加入體積定為0.8mL，但大量文獻使用鹽酸作為溶劑，生成的普魯士藍沉淀在鹽酸中的溶解效果好，因此本實驗選擇0.1mol/L鹽酸作為溶劑。3.2 文獻報道從麩皮中提取的酚酸除阿魏酸外，還有異阿魏酸、對羥基苯甲酸、咖啡酸、丁香酸等，但除咖啡酸以外其他的酚酸在320nm左右沒有紫外吸收，其他物質(zhì)都可忽略不計。龔曉莉等[8]以FeCl3-K3[Fe(CN)6]混合溶液為顯色劑，采用分光光度法測定抗菌植物烏蕨中總酚酸含量，選擇波長717nm為檢測波長。結(jié)果表明該檢測方法簡便可靠、精密度高、重現(xiàn)性好。嚴贊開[9]在用分光光度法測定仙人掌中多酚含量時，使多酚與三氯化鐵-鐵氰化鉀作用后，在720nm測定其吸光度。付煜榮等[10]在采用分光光度法測定三七中總酚酸含量時，選擇FeCl3-K3[Fe(CN)6]混合溶液為顯色劑，檢測波長為720nm。結(jié)果表明此檢測方法重現(xiàn)性好。由于阿魏酸也是一種酚酸，因此借鑒上述文獻中檢測酚酸的方法，選擇檢測波長為720nm。

3.3 測定阿魏酸常用的方法一般有分光光度法[8-11]和色譜法[5,12-14]，熒光分光法[15]以及毛細管電泳[16]。由于高效液相色譜法具有對多組分的高分離能力，測定簡單快速、結(jié)果準確、精密度高的特點，因此是目前測定微量有機物最為有效的分析手段[12]。已有的研究方法主要應用于阿魏酸含量較高的中藥材。如李琰等[13]在測定不同產(chǎn)地當歸中阿魏酸含量時，通過正交實驗確定最佳測定條件，其平均回收率平均為(97.6±1.9)%，RSD=0.7%；葉芳等[14]采用Eclipse DBC18柱，方法平均回收率為99.5%，RSD為1.74%。張志清等[5]采用超聲波輔助堿醇提取麥麩中阿魏酸，并采用高效液相色譜方法測得方法平均回收率97.9%，RSD 0.64%(表7)。將本研究與上述學者的方法比較，可以看出HPLC法測定阿魏酸時的精密度、穩(wěn)定性以及平均回收率都比衍生分光光度法高，及測定的數(shù)據(jù)穩(wěn)定性和測定準確度高。但高效液相色譜儀價格昂貴，限制了其廣泛應用，并且分析較少樣品時分析時間較長，操作復雜，測定成本較高，因此在測定較少樣品時，可選用衍生分光光度法。

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Determination of Ferulic Acid in Wheat Bran by Derivatization Combined with Spectrophotometry

YANG Xue，YAO Yan-yan，ZHANG Zhi-qing*
(College of Food Science, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China)

Objective: To establish a determination method of ferulic acid in wheat bran by derivatization combined with spectrophotometry. Methods: Ferulic acid was analyzed spectrophotometrically at 720 nm. The color-developing agent was the mixture of 0.6 g/100 mL FeCl3 and 0.9 g/100 mL K3Fe(CN)6] (1:0.9). Results: A good linear relationship in the concentration range of 2.36－14.16μg/mL for ferulic acid (r= 0.9996) was observed, and the detection limit of this developed method was 0.022μg/mL. The average recovery rate of this method was 103.1%. Conclusion: This developed method is characteristics of simple operation, accurate results and high average recovery rate, which is suitable for the determination of ferulic acid in wheat bran.

wheat bran；ferulic acid；derived spectrophotometry

TS210.9

A

1002-6630(2011)06-0155-04

2010-05-04

教育部大學生創(chuàng)新性實驗項目(091062627)；四川省人事廳留學人員擇優(yōu)項目(川人函【2008】488號)；

四川省教育廳重點項目(09ZA081)

楊雪(1988—)，女，本科生，主要從事食品檢驗研究。E-mail：yangxue.smile@163.com

*通信作者：張志清(1976—)，男，副教授，博士，主要從事食品、生物樣品檢驗研究。E-mail：zqzhang721@163.com