具有潛在抑制腸道致病菌的乳酸菌的篩選

張英春，張?zhí)m威，韓雪，易華西，杜明，妥彥峰，李靖妍

(1.哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，哈爾濱150090；2.新疆塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾843300）

具有潛在抑制腸道致病菌的乳酸菌的篩選

張英春1，張?zhí)m威1，韓雪1，易華西1，杜明1，妥彥峰2，李靖妍1

(1.哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，哈爾濱150090；2.新疆塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾843300）

以西北地區(qū)發(fā)酵食品分離出的106株乳酸桿菌為材料，通過其代謝產(chǎn)物對腸道致病菌生長的抑制作用、菌體HT-29細(xì)胞的粘附作用和抑制宋內(nèi)志賀氏菌（S.sonnei）對HT-29細(xì)胞的黏附作用篩選出了具有抑制腸道致病菌作用的三株乳酸桿菌，為進(jìn)一步的體內(nèi)實驗奠定了基礎(chǔ)。

乳酸桿菌；致病菌；抑制致病菌生長；抑制黏附

0 引言

乳酸桿菌是人類和動物腸道中一種正常的優(yōu)勢有益菌，能夠維持腸道微環(huán)境的平衡作用[1]。研究表明乳酸桿主要是通過產(chǎn)生抗菌物質(zhì)，競爭粘附位點等方式拮抗多種病原菌的作用[2，3]。然而通過體內(nèi)實驗來篩選具有抑菌作用的乳酸桿菌不僅價格昂貴、而且耗時。因此利用可靠的體外方法篩選具有潛在抑菌活性的菌株是必要的。西北地區(qū)傳統(tǒng)的發(fā)酵制品中擁有豐富的乳酸桿菌資源，這些菌株來源于當(dāng)?shù)氐淖匀画h(huán)境，不僅賦予食品特有的營養(yǎng)價值和風(fēng)味，而且具有很好的抗逆性和益生性。本研究利用乳酸桿菌體外抑制致病菌的生長、抑制致病菌對腸道上皮細(xì)胞的黏附作用[4]的實驗方法對所分離的乳酸桿菌的抑菌活性進(jìn)行了體外篩選研究，為進(jìn)一步的體內(nèi)試驗提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 實驗

1.1 材料

1.1.1 菌株和細(xì)胞株

實驗所用的乳酸桿菌都是分離于西北地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵制品中，主要有甘肅甘南藏族自治州（G）、甘肅肅北蒙古族自治縣（SB）、青海海北藏族自治州牧民自制的牦牛乳酸奶（Q）；新疆哈薩克族牧民自制的馬奶酒（M）及奶酪（X）；西藏拉薩地區(qū)牧民自制的奶酪（T）；蘭州市民自制的發(fā)酵蔬菜汁漿水，分純的乳酸菌經(jīng)過革蘭氏染色、過氧化氫酶試驗初步確定為乳酸桿菌，共計106株。指示菌株為大腸埃希菌（E.coli，ATCC25922），鼠傷寒沙門氏菌（S.typhimurium，ATCC14028），宋內(nèi)志賀氏（S.sonnei，ATCC25931），HT-29細(xì)胞株。

1.1.2 試劑和儀器

MRS用于培養(yǎng)乳酸桿菌，TSA用于培養(yǎng)致病菌，RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液，胰蛋白酶，胎牛血清，蛋白酶K，Biolog AN微生物鑒定板，6孔細(xì)胞培養(yǎng)板、12孔細(xì)胞培養(yǎng)板，雙筒電光顯微鏡，CO2培養(yǎng)箱。

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌抑制致病菌的初篩

采用瓊脂擴散法測定乳酸桿菌對致病菌的抑制性[5]。將分純供試菌株活化2～3代。取1 mL的致病菌懸液（107mL-1）于滅菌的平皿中，傾入滅菌的TSA培養(yǎng)基，待其凝固后，用滅菌的打孔器在平皿內(nèi)打孔，孔徑為5 mm，每個平皿打4個孔，然后每孔中加入50 μL的乳酸桿菌發(fā)酵液，在37℃條件下培養(yǎng)18 h，同時用MRS培養(yǎng)基做陽性對照，記錄抑菌圈的大小，與對照組相比抑菌圈直徑大于等于1 mm為陽性，每個樣品做4個平行。

1.2.2 乳酸菌的黏附性篩選

（1）HT-29細(xì)胞培養(yǎng)

使用RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)HT-29細(xì)胞，HT-29細(xì)胞在5%CO2培養(yǎng)箱里37℃培養(yǎng)，每48 h換液1次，連續(xù)培養(yǎng)15 d。將蓋玻片放在6孔組織培養(yǎng)板中，向孔中加入1 mL濃度為4×105mL-1的細(xì)胞培養(yǎng)液，每天更換細(xì)胞培養(yǎng)液，至到在玻璃蓋玻片上形成單層細(xì)胞。

（2）黏附實驗[6]

乳酸桿菌在MRS液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)18～20 h。取1 mL菌體培養(yǎng)液（108mL-1）并加入1 mL RPMI1640培養(yǎng)液制成2 mL細(xì)菌懸浮液。吸出6孔組織培養(yǎng)板中HT-29細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS緩沖液（pH值為7.4）沖洗HT-29細(xì)胞2次。然后將上述2 mL乳酸桿菌RPMI1640懸浮液加入到培養(yǎng)孔中。組織培養(yǎng)板繼續(xù)在5%CO2和95%空氣的環(huán)境中37℃培養(yǎng)2 h，然后將細(xì)菌懸浮液吸出，用PBS（pH值為7.4）沖洗HT-29細(xì)胞5次，然后用甲醇固定，革蘭氏染色，于100倍油鏡下鏡檢。隨機選取20個視野計數(shù)HT-29細(xì)胞所黏附的細(xì)菌數(shù)，計算每100個細(xì)胞所黏附的細(xì)菌數(shù)，作為黏附指數(shù)（AI），每株菌做2個重復(fù)。

1.2.3 初篩菌株的鑒定

綜合抑菌性和粘附性實驗結(jié)果將初篩菌株進(jìn)行了鑒定。采用Biolog微生物鑒定系統(tǒng)提供的“Biolog AN微生物鑒定板”對7株菌進(jìn)行了鑒定，主要是依據(jù)乳酸桿菌對鑒定板所提供的95種碳源的利用情況進(jìn)行了屬種鑒定。

1.2.4 發(fā)酵液中抑菌物質(zhì)性質(zhì)的分析

本研究將篩選的7株乳酸桿菌制備上清液（Cell-Free Culture Supernatants，CFCS)，將上清液進(jìn)行如下處理[7]，通過瓊脂擴散法來初步測定發(fā)生抑菌作用的主要物質(zhì)，每個處理組為2 mL，每個實驗做3個平行，兩次重復(fù)。

(1)未處理的CFCS；

(2)CFCS對熱的敏感性：將CFCS加熱處理（80℃，15 min）；

(3)CFCS對蛋白酶的敏感性：CFCS中加入蛋白酶κ（200 mg/L）于37℃條件下培養(yǎng)3 h后備用；

(4)用濃度為10 μmol/L的NaOH將CFCS的pH值至6.5。

1.2.5 乳酸桿菌篩選[8，9]

將瓶中培養(yǎng)好的HT-29細(xì)胞解析下來制備成3×105的細(xì)胞懸液，接入到用12孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)至形成單層細(xì)胞。用PBS（pH=7.4）清洗2次后，每孔中加入0.4 mL的1640培養(yǎng)液，然后每個孔中加入100 μL的乳酸桿菌菌懸液（1×108mL-1），在37℃和5%CO2/95%的空氣條件下分別培養(yǎng)1 h，然后加入100 μL的S.sonnei（1×108mL-1），在37℃和5%CO2/95%的空氣條件下繼續(xù)培養(yǎng)1 h。實驗結(jié)束后單層細(xì)胞用PBS洗滌4次后，加入0.5%的TritonX-100，0.5 mL，在冰水浴中解析5 min，從細(xì)胞上解析下來的菌體進(jìn)行梯度稀釋后，用TSA來計數(shù)實驗組和對照組中的S.sonnei數(shù)量，對照組中只加S.sonnei，每個實驗做3個平行，5次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 具有抑菌能力菌株的篩選

通過對傳統(tǒng)發(fā)酵制品中106株乳酸桿菌的抑菌作用篩選，初步篩選出38株對3種致病菌具有不同程度的抑菌作用，如表1。另外大多數(shù)菌株對S.sonnei的抑制作用高于對E.coli和S.typhimurium的抑制作用。同比從漿水中分離的菌株，其抑菌作用更強一些，如：J21-L，J10-L和J23-L等。

2.2 具有黏附性菌株的篩選

乳酸菌能夠黏附到腸道上皮細(xì)胞是其進(jìn)一步發(fā)揮作用的前提，具有較強黏附能力的乳酸桿菌在腸道定殖后，可以有效的防止病原微生物接觸和粘附腸粘膜細(xì)胞，從而預(yù)防腸致病菌引起的腸道疾病[10]。本研究將抑菌效果較好的38株菌株，采用HT-29細(xì)胞株進(jìn)行了黏附實驗，結(jié)果如表1所示。菌株黏附能力的評價標(biāo)準(zhǔn)：每20個視野中菌株的數(shù)量少于50為無黏附能力；黏附的菌株數(shù)量在51～100，具有黏附能力；黏附的菌株數(shù)量超過100為強黏附能力[4]。由表1可以看出，在測定的菌株中黏附指數(shù)大于50的菌株包括SB32，SB14，SB27，M22-L，M7-L，M6-L，M20-L，Q8-L，Q2-L，M5-L，M25-L，Q6-L，Q12-L，X12-L，X2-L，G15-L，G1-L，J21-L，J10-L。結(jié)合乳酸菌株的抑菌性，最后篩選出7株乳酸桿菌。

2.3 初篩菌株的鑒定

采用Biolog微生物鑒定系統(tǒng)對初篩出的7株乳酸桿菌進(jìn)行了鑒定，結(jié)果如表2所示。

表2中，a為根據(jù)Biolog微生物鑒定系統(tǒng)的要求，當(dāng)SIM值＞0.5時,鑒定結(jié)果具有準(zhǔn)確性和可靠性。b為這些傳統(tǒng)發(fā)酵食品采用傳統(tǒng)方法制作，具有獨特的風(fēng)味，深受當(dāng)?shù)鼐用裣矏?，在?dāng)?shù)鼐用竦纳攀持姓紦?jù)重要地位。

2.4 乳酸桿菌發(fā)酵液中抑菌物質(zhì)性質(zhì)的分析

將7株乳酸桿菌的發(fā)酵液進(jìn)行了不同處理后，進(jìn)行了抑菌試驗，結(jié)果如表3。在結(jié)果中可以看出，當(dāng)將CFCS進(jìn)行蛋白酶K處理和熱處理時，并沒有影響其抑菌活性，初步可以判定這7株乳酸桿菌并沒有產(chǎn)生抗菌肽類物質(zhì)。而當(dāng)將CFCS的pH調(diào)至為6.5時，這7株乳酸桿菌的抑菌活性全部消失，初步可以確定乳酸桿菌代謝過程中產(chǎn)生的有機酸類發(fā)揮重要作用。資料也報到了L.casei Shirota和L.rhamnosus GG的抗菌活性主要也是由于產(chǎn)生有機酸的作用[3]。有機酸，特別是丁二酸，不僅對腸道致病菌起到一個屏障作用，而且對于維持腸道的健康也發(fā)揮著重要的作用[11]，另外通過本研究未能篩選出產(chǎn)生抗菌肽的菌株。

表1 初篩乳酸桿菌對致病菌的抑制性及其在HT-29細(xì)胞上的黏附性

表2 篩選乳酸桿菌菌株的鑒定和來源

表3 不同處理乳酸桿菌CFCS對致病菌的抑制作用

2.5 抑制S.sonnei對HT-29細(xì)胞的黏附作用菌株的篩選

圖1為乳酸桿菌抑制S.sonnei在HT-29細(xì)胞上的黏附作用。

圖1 乳酸桿菌抑制S.sonnei的黏附作用

在抑制S.sonnei對HT-29細(xì)胞的黏附性實驗中，從表1的數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析中可以看出，先加入M5-L，Q8-L和J10-L乳酸桿菌菌株培養(yǎng)1 h后，再加入S.sonnei，S.sonnei的黏附菌數(shù)與對照組相比差異顯著（P＜0.05），而且對S.sonnei抑制率分別為55%，36.4%和38.1%。而J21-L，X12-L，Q6-L和G15-L加入后，雖然S.sonnei的黏附菌數(shù)與對照組相比也有所減少，但是統(tǒng)計分析差異不顯著（P＞0.05），對S.sonnei抑制率都低于30%。資料已經(jīng)報到了Lactobacillus crispatus strain ZJ001能夠抑制39%和35%的E.coli和S.typhimurium對上皮細(xì)胞的粘附作用[12]。另外Candeal et al.報道[8]了菌株Lactobacillus acidophilus Bar13和L.plantarum Bar10能夠抑制腸道致病菌E.coli和S.typhimurium在Caco-2細(xì)胞上黏附，因此利用乳酸桿菌預(yù)防腸道致病菌引起的某些腸道疾病是具有一定基礎(chǔ)的。

3 結(jié)論

通過乳酸桿菌代謝產(chǎn)物體外抑制致病菌的生長和乳酸桿菌對HT-29細(xì)胞的黏附作用，初步篩選出7株乳酸桿菌L.paracasei subp.paracasei M5-L，L.rhamnosus J10-L，L.paracasei subp.paracasei J21-L，L.casei Q8-L，L.paracasei subp.paracasei X12-L，L.delbrueckii subsp.bulgaricus Q6-L和L.paracasei subp.paracasei G15-L。

通過抑制S.sonnei對HT-29上皮細(xì)胞的粘附作用研究，從7株乳酸桿菌中篩選出3株具有顯著抑制作用的菌株L.paracasei subp.paracasei M5-L，L.rhamnosus J10-L和L.casei Q8-L。為進(jìn)一步的體內(nèi)試驗研究提供實驗數(shù)據(jù)。

[1] SANDINE W E.Role of Lactobacillus in the Intestinal Tract[J].Journal of Food Protection,1979,42:259-262.

[2] COCONNIER M H V,LIEVIN M F,BERNET-CAMARD S,et al.Antibacterial Effect of the Adhering Human Lactobacillus Acidophilus Strain LB[J].Antimicrobial Agents and Chemotherapy,1997,41:1046-1052.

[3] MAKRAS L,TRIANTAFYLLOU V,FAYOL-MESSAOUDI D,et al.Kinetic Analysis of the Antibacterial Activity of Probiotic Lactobacilli towards Salmonella enterica serovar Typhimurium Reveals a Role for Lactic Acid and Other Inhibitory Compounds[J].Research in Microbiology,2006,157:241-247.

[4] RAMIAH K,REENEN CA,DICKS LMT.Surface-bound proteins of Lactobacillus plantarum 423 that contribute to adhesion of Caco-2 cells and their role in competitive exclusion and displacement of Clostridium sporogenes and Enterococcus faecalis[J].Research in microbiology,2008,159:470-475.

[5] RAMMELSBERG M,RADLER F.Antibacterial Polypeptides of Lactobacillus Species[J].Journal of Applied Bacteriology,1990,69:177-184.

[6] CHAUVIERE G,COCONNIER M H,KERNEIS S,et al.Adherence of Human Lactobacillus acidophilus onto Human Enterocyte-Like Cells,Caco-2 and HT-29 in Culture[J].Journal of General Microbiology,1992,138:1689-1696.

[7] JONES R J,HUSSEIN H M,ZAGOREC M.Isolation of Lactic Acid Bacteria with Inhibitory Activity against Pathogens and Spoilage Organisms associated with Fresh Meat[J].Food Microbiology,2008,25:228-234.

[8] CANDELA M,PERNA F,CARNEVALI P,et al.Interaction of Probiotic Lactobacillus and Bifidobacterium Strains with Human Intestinal EpithelialCells:AdhesionProperties,CompetitionagainstEnteropathogens and modulation of IL-8 Production[J].International Journal of Food Microbiology,2008,125:286-292.

[9] RAMIAH K,REENEN C A,DICKS L M T.Surface-Bound Proteins of Lactobacillus plantarum 423 That Contribute to Adhesion of Caco-2 Cells and Their Role in Competitive Exclusion and Displacement of Clostridium sporogenes and Enterococcus faecalis[J].Research in Microbiology,2008,159:470-475.

[10] FERNáNDEZ M.F.,BORIS S.,BARB?S C.Probiotic Properties of Human Lactobacilli Strains to be Used in the Gastrointestinal Tract[J].Journal of Applied Microbiology,2003,94:449-455.

[11] COOK S I,SELLIN J H.Short chain fatty acids in health and disease[J].Alimentary Pharmacology and Therapeutics,1998,12:499-507.

[12] CHEN X Y,XU J J,SHUAI J B,et al.The S-layer Proteins of Lactobacillus crispatus Strain ZJ001 is Responsible for Competitive Exclusion against Escherichia coli O157:H7 and Salmonella typhimurium.International Journal of Food Microbiology[J].2007,115:307-312.

In vitro screening of Lactobacilli strains potential to inhibition the Enteropathogens

ZHANG Ying-chun1,ZHANG Lan-wei1,HAN Xue1，YI Hua-xi1，DU Ming1，TUO Yan-feng2,LI Jing-yan1
(1.School of Food Science and Engineering,Harbin Institute of Technology,Harbin 150090,China 2.Department of Life Science,Tarim University,Alar,Sinkiang 843300,China)

By analyzing the production of antimicrobial molecules active against E.coli,S.typhimurium and S.sonnei,adherence to HT-29 cells and inhibition of S.sonnei adherence to HT-29 cells,Three lactobacilli were screened from 106 lactobacilli strains from Chinese fermented food for inhibition the enteropathogens,which could lay a foundation for further investigation in vivo

Lactobacilli;enteropathogens;inhibition the growth of enteropathogens;inhibition adhesion

Q93.331

A

1001-2230（2011）02-0009-04

2010-10-19

益生菌定向選育及其高活性制品開發(fā)關(guān)鍵技術(shù)（2007AA10 Z354）。

張英春（1975-），女，講師，研究方向為乳酸菌及其活性產(chǎn)物研究。

張?zhí)m威