包秋華，陳永福，張家超，孫志宏，包艷，張和平

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點實驗室，呼和浩特010018)

一種快速定性和定量檢測發(fā)酵乳中L.fermentum的方法

包秋華，陳永福，張家超，孫志宏，包艷，張和平

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點實驗室，呼和浩特010018)

通過比對發(fā)酵乳桿菌（L.fermentum）與其他乳酸菌的16S rRNA基因序列的異同，設(shè)計出L.fermentum的種屬特異性引物，應(yīng)用此引物進行種屬特異性PCR和實時熒光定量PCR反應(yīng)，通過瓊脂糖凝膠電泳圖譜和實時熒光定量PCR圖譜分析，建立一種快速檢測發(fā)酵乳中L.fermentum的定性和定量測定方法。

乳酸菌；發(fā)酵乳桿菌；PCR；實時熒光定量PCR

0 引言

目前對多菌復(fù)合的發(fā)酵乳樣本中發(fā)酵乳桿菌(L.fermentum)的定性、定量檢測方面缺乏科學(xué)、合理、快速的方法[1-5]，傳統(tǒng)生理生化方法易受選擇培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件、菌種特性等因素影響，檢測效率有限[1]。乳酸菌活菌數(shù)量是評價活性乳酸菌制品質(zhì)量的重要指標(biāo)[3,6-8]，平板菌落計數(shù)法是微生物學(xué)中最常見、最標(biāo)準(zhǔn)的一種活菌計數(shù)方法，但操作繁瑣，耗時費力，對乳酸菌培養(yǎng)還需要厭氧裝置[6]。與傳統(tǒng)的理化鑒定和平板定量方法相比，16S rDNA基礎(chǔ)上的PCR和實時熒光定量PCR方法檢測乳酸菌更加快速，而且特異性和敏感性更強[1,4-5,7,9-10]。其中Dickson曾采用種屬特異性引物成功定性分析了臨床醫(yī)學(xué)樣本的L.fermentum[1]。本文設(shè)計種屬特異性引物利用PCR和RT-PCR技術(shù)建立了一種快速定性、定量檢測發(fā)酵乳中L.fermentum的方法。

1 實驗

1.1 菌種和樣本來源

標(biāo)準(zhǔn)菌株L.fermentum 1.1880，L.rhamnosus 1.2134，L.plantarum 1.2437，標(biāo)準(zhǔn)菌株L.acidophilus ATCC 4356，L.casei ATCC393；L.fermentum F6為本實驗室從酸奶中分離得到具有益生特性的發(fā)酵乳桿菌[2,11]。傳統(tǒng)發(fā)酵乳酸奶樣（25#和36#）為本實驗室于2009年從西藏采的自然發(fā)酵乳樣品。

1.2 主要試劑

載體pMD-18T，Taq DNA polymerase，DNase I，反轉(zhuǎn)錄和實時定量的試劑盒（SYBRPrimeScriptTMRT-PCR Kit，DRR063A，包括：DRR037S和DRR 041A）；Trizol試劑盒。

1.3 主要儀器

PTC-200梯度PCR儀，ND-1000型微量紫外分光光度計，Bio-Rad IQ5 Real-Time PCR儀，美國MP FastPrep-24快速核酸提取儀。

2 方法

2.1 引物的設(shè)計

從Genbank中下載L.fermentum不同菌株及其他乳酸菌標(biāo)準(zhǔn)株的16S rDNA序列，然后利用DNAStar中MegAlign進行序列比對，尋找種內(nèi)保守區(qū)域，利用Primer 5.0進行引物設(shè)計，并通過GenBank中Blast檢測引物特異性，獲得L.fermentum的特異種引物。引物序列如下：上游引物L(fēng)Ff：5’-ATGGTGCTTGCACCTGATTG-3’，下游引物L(fēng)Fr：5’-ACTACCAGGGTAT CTAATC C-3’，預(yù)計擴增片斷長度為746 bp；引物由上海桑尼有限公司合成。

2.2 L.fermentum 1.1880的16S rDNA基因的克隆

采用CTAB法和凍融法[12]提取L.fermentum 1.1880的基因組DNA，DNA純化后取約100 ng DNA做PCR反應(yīng)的模板。反應(yīng)體系25.0 μL：2.5 μL 10×PCR Buffer（含Mg2+），2 μL 2.5 mmol/L dNTPs，共2.5 μL 5 mmol/L上下游引物（LFf和LFr），0.3 μL 5 U/μL Taq酶，用二次蒸餾水補足至25.0 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性40 s，62℃退火30 s，72℃延伸1 min，循環(huán)40次；72℃延伸8 min。PCR擴增產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳檢測。然后將L.fermentum 1.1880的PCR產(chǎn)物純化后與pMD-18T連接并轉(zhuǎn)化DH5感受態(tài)細胞，經(jīng)藍白斑篩選、PCR、酶切分析等方法檢測獲得陽性克隆子pFT[13]。

2.3 外標(biāo)準(zhǔn)品的制備

提取以含有目的擴增片斷的質(zhì)粒pFT總DNA，紫外分光光度計測定A值后，計算出拷貝數(shù)，做10倍系列稀釋，梯度稀釋至109～102拷貝數(shù)/μL的濃度，以此作為外標(biāo)準(zhǔn)品進行熒光定量PCR反應(yīng)。

2.4 樣本的RNA提取和反轉(zhuǎn)錄

按Trizol試劑盒（Invitrogen）說明書提取樣品RNA，然后用DNase I處理兩次，確保完全消除RNA中的DNA污染，得到純化的RNA。反轉(zhuǎn)錄擴增按大連寶生物工程有限公司（TaKaRa Code:DRR037S）說明書進行，反轉(zhuǎn)錄擴增反應(yīng)條件：42℃反應(yīng)15 min；85℃變性5 s，在溫度-20℃下保存。

2.5 實時熒光定量PCR和定量反應(yīng)系統(tǒng)特異性評定

以待測樣品cDNA和外標(biāo)準(zhǔn)品為模板，用L.fermentum種特異性引物進行熒光定量PCR擴增。熒光定量PCR反應(yīng)參數(shù)：95℃變性25 s，95℃變性25 s，60℃退火22 s，40個循環(huán)。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線和相應(yīng)的計算機軟件實現(xiàn)發(fā)酵乳中L.fermentum的快速定量檢測。

繪制融解曲線的范圍從70℃緩慢升溫至95℃，溫度每升高0.5℃讀一次熒光值，由IQ5 Real-Time PCR儀自動繪制融解曲線。

3 結(jié)果與分析

3.1 快速定性檢測L.fermentum

取L.fermentum和其他乳桿菌采用PCR方法檢測引物的特異性并定性檢測發(fā)酵乳中的L.fermentum，樣本經(jīng)L.fermentum的種屬特異性引物擴增，在746 bp處出現(xiàn)預(yù)期特征條帶時，表明含有L.fermentum，若在預(yù)期的位置沒有檢測到特征條帶，則表明此樣品中不含L.fermentum，其中部分結(jié)果如圖1所示。圖1中，7～10為L.fermentum外的其他種乳酸菌，結(jié)果為陰性，說明引物特異性好，與預(yù)期結(jié)果一致。泳道5～6為從西藏采的自然發(fā)酵乳樣本，沒有預(yù)期特征條帶出現(xiàn)，說明這2個樣本中沒有L.fermentum。

圖1 發(fā)酵乳桿菌的引物特異性驗證及樣本的定性檢測

圖1中，M為DL2000 Marker；1為pFT作為陽性對照；2為dH2O作陰性對照；3為L.fermentum 1.1880；4為L.fermentum F6；5為酸奶樣25#（從西藏采的傳統(tǒng)發(fā)酵乳）；6為酸奶樣36#（從西藏采的自然發(fā)酵乳）；7為L.casei ATCC393；8為L.rhamnosus 1.2134；9為L.acidophilus ATCC 4356；10為L.plantarum 1.2437。

3.2 L.fermentum的快速定量檢測方法的建立

以不同拷貝數(shù)的陽性模板pFT的對數(shù)為橫坐標(biāo)，以PCR反應(yīng)過程中到達熒光閾值的初始循環(huán)數(shù)(Ct值)為縱坐標(biāo)得到L.fermentum的標(biāo)準(zhǔn)曲線。由圖2可見，Ct值和拷貝數(shù)呈線性關(guān)系，熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=-3.392X+39(Y為Ct值，X為初始模板量的對數(shù))，初始濃度與Ct值之間線性相關(guān)系數(shù)R2為0.991，斜率為－3.392。R2＞0.9表明所建立的L.fermentum標(biāo)準(zhǔn)曲線符合Real-Time PCR定量的要求。取L.fermentum F6的發(fā)酵豆乳15 h的乳樣進行實時熒光定量PCR，經(jīng)與標(biāo)準(zhǔn)曲線對比計算后為7.3±0.4 g-1。

圖2 實時熒光定量檢測發(fā)酵乳桿菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線

4 結(jié)論

本文利用生物信息學(xué)方法設(shè)計L.fermentum種特異性引物，采用PCR和Real-Time PCR絕對定量技術(shù)成功建立了發(fā)酵乳中L.fermentum的快速定性和定量檢測方法，此技術(shù)具有特異性強、重復(fù)性好、準(zhǔn)確、快速等優(yōu)點，并已經(jīng)申請專利。定性分析的關(guān)鍵是特異性引物的設(shè)計和PCR條件的摸索；絕對實時熒光定量分析的關(guān)鍵是標(biāo)準(zhǔn)品的制備，本文選擇含有熒光定量PCR擴增片段克隆到質(zhì)粒中回收質(zhì)粒，構(gòu)建了含有目的條帶的重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品，實驗證實可靠易行。實驗過程中還發(fā)現(xiàn)，若利用絕對定量分析樣本中活菌的數(shù)量當(dāng)提取RNA時最好采用核酸提取儀破碎原始樣本中的細胞，比液氮研磨法獲得RNA多，不易降解，大大提高準(zhǔn)確率。

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A rapid qualitative and quantitative detection method of L.fermentum in the fermented milk

BAO Qiu-hua,CHEN Yong-fu,ZHANG Jia-chao,SUN Zhi-hong,BAO Yan,ZHANG He-ping
(Key Laboratory of Dairy Biotechnology and Engineering Ministry of Education ministry Inner Mongolia Agricultural University,Hohhot Inner Mongolia 010018,China)

The differences in 16S rRNA gene region between L.fermentum and other Lactic acid bacteria were compared.The species specificity primer of L.fermentum was designed and used to carry out species-specific PCR assay and fluorescent quantitative real-time PCR.Through analyzing the electrophoretic pattern and the curve of RT-PCR,a rapid qualitative and quantitative method for the detection of L.fermentum in the fermented milk was established.

Lactic acid bacteria;L.fermentum;Species-specific PCR;Real-Time PCR

TS252.7

A

1001-2230（2011）02-0059-03

2010-10-08

973計劃前期研究專項(2010CB134502)；教育部創(chuàng)新團隊發(fā)展計劃(IRT0967)；國家自然科學(xué)基金項目（No.30760156）。

包秋華（1973-），女，助理研究員，研究方向為乳品微生物。

張和平