侯彩云，趙靜，劉瑩，王旭，黃昕

（中國農(nóng)業(yè)大學功能乳品教育部北京市共建重點實驗室，北京100083）

乳品真蛋白率的提出及測定

侯彩云，趙靜，劉瑩，王旭，黃昕

（中國農(nóng)業(yè)大學功能乳品教育部北京市共建重點實驗室，北京100083）

利用三氯乙酸-雙縮脲比色法對添加乳清蛋白乳粉的蛋白質(zhì)量分數(shù)進行測定。結(jié)果表明，乳清蛋白的加標回收率在89.2%～99%之間，重現(xiàn)性在0.26%～0.98%之間，表明三氯乙酸-雙縮脲比色法可以較好地檢測出乳中的真蛋白。提出了真蛋白率的概念，并測定出乳粉的真蛋白率范圍在78.06%～89.90%之間；液態(tài)乳的真蛋白率范圍在90.03%～96.25%之間。

三氯乙酸-雙縮脲比色法；凱氏定氮法；蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)；真蛋白率

0 引言

蛋白質(zhì)是乳品質(zhì)量優(yōu)劣的重要指標[1]。我國現(xiàn)行國家標準規(guī)定乳制品中蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)的測定方法為凱氏定氮法（簡稱K法）[2]。根據(jù)其測定原理，K法的測定值為樣品中粗蛋白的質(zhì)量分數(shù)[3]。正常情況下，乳粉中的非蛋白氮質(zhì)量分數(shù)在總氮中所占比例是基本穩(wěn)定的[4，5]。然而，一旦在樣品中添加了非蛋白含氮物，就會對K法的測定結(jié)果產(chǎn)生影響。K法的這一漏洞曾經(jīng)給一些不法廠商的制假售劣提供了可乘之機。

與粗蛋白相對，真蛋白質(zhì)量分數(shù)可以較好地反映乳的真實營養(yǎng)價值[6]。為此，本研究室提出了一種三氯乙酸-雙縮脲比色法（簡稱T+B法）[7]，在此基礎上，提出了真蛋白率的概念，以期找到一種可以較為有效地排除包括尿素、三聚氰胺和水解蛋白在內(nèi)的多種非蛋白含氮物對乳品中蛋白質(zhì)量分數(shù)測定影響的方法，為鑒別非蛋白含氮物的非法添加提供必要的技術(shù)依據(jù)。

1 實驗

1.1 材料

12種市購液態(tài)乳；15種市購乳粉。

酪蛋白標準品，牛血清蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA）標準品，乳清蛋白（質(zhì)量分數(shù)為60%），雙縮脲試劑，四氯化碳，三氯乙酸，體積分數(shù)為95%乙醇。

雙縮脲試劑：將濃度為10 mol/L氫氧化鉀10 mL和質(zhì)量濃度為250 g/L酒石酸鉀鈉溶液20 mL加到約800 mL蒸餾水中，劇烈攪拌，同時緩慢加入質(zhì)量濃度為40 g/L的硫酸銅溶液30 mL，定容至1 000 mL。

硼酸-指示劑混合液：溴甲酚綠0.5 g，甲基紅0.1 g溶解于體積分數(shù)為95%乙醇中，稀釋至100 mL即為硼酸指示劑混合液。

催化劑：五水合硫酸銅10 g，硫酸鉀100 g，在研缽中研磨，過40目篩。

濃度為0.01 mol/L鹽酸標準溶液，質(zhì)量分數(shù)為2%硼酸，質(zhì)量分數(shù)為35%氫氧化鈉，濃硫酸，亞甲基蘭-甲基紅指示劑。

1.2 儀器

分析天平，電子天平，752型分光光度計，高速冷凍離心機(GL220G2Ⅱ)，超聲波清洗器(KQ1002DB)，消煮爐（KXL-1010），定氮儀（KDY-9820）。

1.3 方法

1.3.1 現(xiàn)行國標蛋白質(zhì)測定方法

分別精確稱取15種乳粉0.2000 g，編號為1～16，順序加入0.5～0.55 g的催化劑，5 mL的濃硫酸，放在消煮爐上消化；消化完全并待樣品冷卻后，用凱氏定氮儀蒸餾，并用已標定的濃度為0.1 mol/L的鹽酸滴定，計算得到樣品蛋白質(zhì)量分數(shù)。樣品平行測定3次[8]。

分別精確稱取12種液態(tài)乳1.5000 g，編號為1～12，順序加入0.5～0.55 g的催化劑，5 mL的濃硫酸，放在消煮爐上消化；消化完全并待樣品冷卻后，用凱氏定氮儀蒸餾，并用已標定的濃度為0.2 mol/L的鹽酸滴定，計算得到樣品蛋白質(zhì)量分數(shù)，記為Pk。樣品平行測定3次[8]。

1.3.2 T+B法測定各種乳的蛋白質(zhì)量分數(shù)

1.3.2.1 標準曲線的繪制

按表1加入酪蛋白標準品和雙縮脲試劑，充分混勻。繪制酪蛋白標準曲線。樣品平行測定3次。

表1 酪蛋白標準曲線的制作

1.3.2.2 樣品蛋白質(zhì)量分數(shù)的測定

精確稱取乳粉0.2000 g，置于50 mL離心管中，加入2 mL水溶解均勻。加入15%三氯乙酸溶液5 mL混勻，靜置10 min，10 000 r/min下離心10 min。棄去上清液，加入體積分數(shù)為95%無水乙醇10 mL混勻，10 000 r/min下離心5 min。棄去上清液，加入四氯化碳2 mL和雙縮脲試劑20 mL，用超聲波清洗器震蕩均勻，使蛋白溶解，靜置顯色10 min，10 000 r/min下離心20 min。以0管調(diào)零，540 nm下測定表1配制的標準溶液的吸光度值。以各管真蛋白濃度為縱坐標，吸光度值為橫坐標，繪制標準曲線。同時測定上述提取蛋白液的吸光度值，并根據(jù)標準曲線的線性回歸方程讀取試液的真蛋白質(zhì)量濃度c。樣品平行測定3次。

精確稱取液態(tài)乳1.5000 g，置于50 mL離心管中。加入質(zhì)量分數(shù)為15%三氯乙酸溶液5 mL混勻，靜置10 min，10 000 r/min下離心10 min。棄去上清液，加入體積分數(shù)為95%無水乙醇10 mL混勻，10 000 r/min下離心5 min。棄去上清液，加入四氯化碳2 mL和雙縮脲試劑20 mL，用超聲波清洗器震蕩均勻，使蛋白溶解，靜置顯色10 min，10 000 r/min下離心20 min。以0管調(diào)零，540 nm下測定表1配制的標準溶液的吸光度值。以各管真蛋白濃度為縱坐標，吸光度值為橫坐標，繪制標準曲線。同時測定上述提取蛋白液的吸光度值，并根據(jù)標準曲線的線性回歸方程讀取試液的真蛋白質(zhì)量濃度c。樣品平行測定3次[7]。

按下式計算乳品試樣的蛋白質(zhì)量分數(shù)P0：

式中：P0為乳品中真蛋白的質(zhì)量分數(shù)；c為試液蛋白質(zhì)量濃度；m0為取樣量。

1.3.2.3 乳清蛋白的添加對T+B法測定結(jié)果的影響

精確稱取乳粉0.2000 g 7份，編號為1-7；按照表2所示分別向其中7份添加乳清蛋白，置于50 mL離心管中，加入2 mL水溶解均勻。加入15%三氯乙酸溶液5 mL混勻，靜置10 min，10000 r/min下離心10 min。棄去上清液，加入95%無水乙醇10 mL混勻，10000 r/min下離心5 min。棄去上清液，加入四氯化碳2 mL和雙縮脲試劑20 mL，用超聲波清洗器震蕩均勻，使蛋白溶解，靜置顯色10 min，10 000 r/min下離心20 min。以0管調(diào)零，540 nm下測定表1配制的標準溶液的吸光度值。以各管真蛋白濃度為縱坐標，吸光度值為橫坐標，繪制標準曲線。同時測定上述提取蛋白液的吸光度值，并根據(jù)標準曲線的線性回歸方程讀取試液的真蛋白質(zhì)量濃度c。樣品平行測定3次。按1.3.2.2中的公式計算P0。

表2 乳粉中添加乳清蛋白的配制

1.3.3 乳品真蛋白率的提出與計算

按下式計算三氯乙酸-雙縮脲法（T+B法）和凱氏定氮法所測定乳品蛋白質(zhì)量濃度的比率，記為δP，該值稱為真蛋白率，表示乳品中真實的蛋白質(zhì)量分數(shù)在粗蛋白質(zhì)量分數(shù)中所占的比率。

式中：δP為真蛋白率；P0為真蛋白的質(zhì)量分數(shù)；Pk為樣品中粗蛋白的質(zhì)量分數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 T+B法測定樣品蛋白質(zhì)量分數(shù)

2.1.1 乳清蛋白的添加對T+B法測定乳粉蛋白質(zhì)量分數(shù)的影響

圖1是不同添加量的乳清蛋白對乳粉的蛋白質(zhì)量分數(shù)的影響。可以看出，隨著乳清蛋白添加量的增加，乳粉的蛋白質(zhì)量分數(shù)也相應增加，表明T+B法測定乳粉的蛋白質(zhì)量分數(shù)時，乳清蛋白被三氯乙酸沉淀了，并且乳清蛋白和酪蛋白一起與雙縮脲試劑發(fā)生顯色反應。

圖1 乳粉的蛋白質(zhì)量分數(shù)

2.1.2T+B法測定乳粉蛋白質(zhì)量分數(shù)時乳清蛋白的回收率和重現(xiàn)性

通過加入乳清蛋白進行定性，可以檢測到乳清蛋白的加標回收率在89.2%～99%之間，重現(xiàn)性在0.26%～0.98%之間。說明T+B法測定添加乳清蛋白的乳粉的蛋白質(zhì)量分數(shù)時，乳清蛋白可以被較好的定量檢測出來。

2.2 兩種方法測定結(jié)果的比較

表3和表4為凱氏定氮法和T+B法分別測定的12種液態(tài)乳和15種乳粉的蛋白質(zhì)量分數(shù)。

表3 12種液態(tài)乳的蛋白質(zhì)量分數(shù)%

表4 15種乳粉的蛋白質(zhì)量分數(shù)%

由表3和表4可以看出，凱氏定氮法和T+B法測定的乳粉和液態(tài)乳的蛋白質(zhì)量分數(shù)具有一致性。通過成對t檢驗，|t|＜t(0.05,n)(n=12,15)，說明T+B法與凱氏定氮法測定乳粉和液態(tài)乳蛋白質(zhì)量分數(shù)時，兩者不存在顯著性的差異。

2.3 乳品真蛋白率的測定與分析

圖2和圖3分別是液態(tài)乳和乳粉的真蛋白率測定結(jié)果。由圖2可以看出，液態(tài)乳的真蛋白率范圍在90.03%～96.25%之間，表明液態(tài)乳中非蛋白含氮物在粗蛋白中所占的比例并非定值，可能會因各種因素的影響，在一定的范圍內(nèi)有所波動。由圖3可以看出，乳粉的真蛋白率范圍在78.06%～89.90%之間，表明乳粉的真蛋白率普遍低于液態(tài)乳。之所以如此，一方面可能是因為加工工藝的需要，另一方面也可能是存在人為添加非蛋白含氮物的結(jié)果。與粗蛋白相比，真蛋白可以更加直觀地反映乳品的真實營養(yǎng)價值。對于市售乳品而言，真蛋白率應該穩(wěn)定在一定的范圍內(nèi)。如果某種乳品的真蛋白率過低，表明有可能存在人為添加外源含氮物質(zhì)的情況，應通過對其中的乳蛋白甚至氨基酸的構(gòu)成進行進一步分析的方式，以確認其質(zhì)量是否名實相符。

圖2 液態(tài)乳的真蛋白率

圖3 乳粉的真蛋白率

3 結(jié)論

利用T+B法對添加乳清蛋白乳粉的蛋白質(zhì)量分數(shù)進行測定時，乳清蛋白的加標回收率在89.2%～99%之間，重現(xiàn)性在0.26%～0.98%之間，重現(xiàn)性較好，表明T+B法可以較好地檢測出乳中的真蛋白。

凱氏定氮法和T+B法測定乳品的蛋白質(zhì)量分數(shù)具有一致性。提出了真蛋白率的概念，對于不同乳品而言，真蛋白率應穩(wěn)定在一定的范圍內(nèi)，如果某種乳品的真蛋白率測定值與其合理的范圍偏差過大，則說明該乳品可能存在人為添加非蛋白含氮物的情況。對所收集樣品的測定，表明乳粉的真蛋白率在78.06%～89.90%之間；液態(tài)乳的真蛋白率在90.03%～96.25%之間。

[1] 程濤，孫艷波，李健.雙縮脲法測定乳中酪蛋白含量[J].中國乳品工業(yè)，2000，28(3)：33-35.

[2] 食品安全國家標準.GB 5009.5-2010，食品中蛋白質(zhì)的測定[S].北京：中國標準出版社，2010.

[3] 盛成樂.關于凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)的幾個問題[J].中國釀造，2002（2）：43-44.

[4]武健新.牛乳蛋白質(zhì)的性質(zhì)及應用[J].中國乳品工業(yè)，1997，25（2）：18-21.

[5] 陳靖，侯彩云，牛巍，等.乳粉蛋白氮數(shù)字圖像檢測方法的研究[J].食品科技，2007(9)：210-212.

[6] 劉東紅，唐佳妮，呂元，等.乳品真蛋白—定義、分析方法、計價及影響因素[J].中國食品學報，2008，8（5）：115-119.

[7] 侯彩云，王加啟，劉鳳巖，等.NY/T1678-2008，乳與乳制品中蛋白質(zhì)的測定雙縮脲比色法[S].北京：中國標準出版社，2008.

Determination on the ratio of true protein in milk products

HOU Cai-yun,ZHAO Jing,LIU Ying,WANG Xu,HUANG Xin
(College of Food Science and Nutritional Engineering,China Agricultural University,Beijing 100083,China)

The protein content is determined by trichloroacetic acid－biuret method in milk powder.The recovery of whey protein is 89.2%～99%and the detection limit is 0.26%～0.98%,which shows the true protein can be well determined by trichloroacetic acid－biuret method.The concept of true protein ratio is proposed,and the true protein ratio in the milk powder and raw milk is 78.06%～89.90%and 90.03%～96.25%respectively.

trichloroacetic acid-biuret method；Kjeldahl nitrogen method；the protein content；true protein ratio

TS252.1，TS252.7

A

1001-2230（2011）02-0056-03

2010-11-15

農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項目（2009GB23600525）。

侯彩云（1963-），女，教授，從事食品質(zhì)量安全方面的研究。