豬血多肽亞鐵螯合鹽的體外抗氧化作用研究

汪學(xué)榮，彭祥偉，闞建全

（1.西南大學(xué)榮昌校區(qū)動物科學(xué)系，重慶402460；2.重慶市畜牧科學(xué)研究院，重慶402460；3.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715）

豬血多肽亞鐵螯合鹽的體外抗氧化作用研究

汪學(xué)榮1，彭祥偉2，闞建全3，﹡

（1.西南大學(xué)榮昌校區(qū)動物科學(xué)系，重慶402460；2.重慶市畜牧科學(xué)研究院，重慶402460；3.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715）

研究了豬血多肽亞鐵螯合鹽對超氧陰離子自由基（O2-·）和過氧化氫（H2O2）的清除作用，并比較了維生素C、豬血多肽亞鐵和豬血多肽對二者的清除能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：豬血多肽亞鐵螯合鹽能清除超氧陰離子自由基（O2-·）和過氧化氫（H2O2），維生素C、豬血多肽亞鐵和豬血多肽這三種物質(zhì)對超氧陰離子自由基（O2-·）和過氧化氫（H2O2）清除能力的強(qiáng)弱順序?yàn)榫S生素C＞豬血多肽亞鐵＞豬血多肽，故豬血多肽亞鐵螯合鹽具有較強(qiáng)的清除超氧陰離子自由基（O2-·）和過氧化氫（H2O2）的能力。

豬血多肽亞鐵，抗氧化作用，超氧陰離子，過氧化氫

多肽鐵是將蛋白質(zhì)酶解后得到的多肽與亞鐵鹽螯合形成的一種生物活性物質(zhì)，可以直接被腸粘膜細(xì)胞吸收，不產(chǎn)生任何消化道刺激癥狀，生物利用率高，是理想的補(bǔ)鐵劑[1]。國外關(guān)于多肽鐵功能特性方面的研究報(bào)道較少。國內(nèi)學(xué)者張亞麗等[2]以1398中性蛋白酶水解豆粕得到的多肽與亞鐵鹽絡(luò)合制備了多肽絡(luò)合亞鐵，初步研究了其抗氧化作用，結(jié)果表明脫脂豆粕多肽絡(luò)合亞鐵對豬油具有抑制自動氧化的作用。劉安軍等[3]采用不同方法研究了多肽-Fe的抗氧化功能，結(jié)果表明其對MDA的生成有一定的抑制作用，對氧自由基和雙氧水均有很強(qiáng)的消除作用，證明了多肽-Fe具有較強(qiáng)的抗氧化作用。鄧尚貴等[4]以南海低值魚蛋白為原料，采用木瓜蛋白酶和風(fēng)味酶的復(fù)合酶水解得到多肽水解物（HP），并制備多肽-鐵（Ⅱ）螯合物，對螯合產(chǎn)物的抗氧化和抗菌功能特性進(jìn)行了初步研究，結(jié)果表明多肽螯合鐵具有明顯的抗氧化活性和顯著的抗枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌活性。王麗霞等[5]探討了多肽-Fe預(yù)防和治療缺鐵性貧血的效果及其口服的安全性，結(jié)果表明多肽-Fe抗貧血效果優(yōu)于NaFeEDTA。筆者在前期研究中利用2709堿性蛋白酶水解豬血制備了豬血多肽，并將其與氯化亞鐵螯合制備了豬血多肽鐵螯合鹽[6-7]。本文以豬血多肽鐵螯合鹽為原料，主要研究了其體外抗氧化作用，以期為豬血多肽鐵螯合鹽的實(shí)際應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和有益參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豬血多肽、豬血多肽亞鐵螯合鹽 實(shí)驗(yàn)室自制；鄰苯三酚、過氧化氫、乙醇、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、鹽酸、檸檬酸、磷酸、碘化鉀、硫代硫酸鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、抗壞血酸（Vc） 分析純；可溶性淀粉 食品級。

UV755B紫外可見分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；DK-8D電熱恒溫水浴鍋 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；78-1磁力加熱攪拌器 杭州儀表電機(jī)廠；PHS-3C+酸度計(jì) 上海雷磁儀器廠；ESJ120-4型電子分析天平 沈陽龍騰電子有限公司；離心機(jī) 北京醫(yī)用離心機(jī)廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 豬血多肽亞鐵螯合鹽對超氧陰離子自由基（O2-·）的清除作用

1.2.1.1 鄰苯三酚自氧化過程中吸光度隨時間的變化關(guān)系[8]采用測定樣品對堿性鄰苯三酚體系（非酶體系）產(chǎn)生的O2-·的抑制作用，即利用鄰苯三酚自氧化反應(yīng)測定自由基抑制劑對其產(chǎn)生的超氧陰離子自由基的抑制作用。在堿性條件下（磷酸鹽緩沖溶液pH8.2），鄰苯三酚會迅速發(fā)生自氧化，同時釋放出超氧陰離子，并且鄰苯三酚的自氧化速率與超氧陰離子的濃度有關(guān)。

取50mmol/L pH8.2的Tris-HCl緩沖溶液4.5mL和不同濃度的樣品溶液0.1mL，置于25℃水浴中預(yù)熱20min，加入2.5mmol/L的鄰苯三酚0.4mL，迅速搖勻，傾入1cm的比色杯中，在325nm處，每隔30s測吸光度1次，連續(xù)測定5min，空白對照組以雙蒸水代替樣品，根據(jù)鄰苯三酚吸光度隨時間的變化曲線來表示。

1.2.1.2 不同濃度樣品對超氧陰離子的抑制率測定[9]

取50mmol/L pH8.2的Tris-HCl緩沖溶液4.5mL和不同濃度的樣品0.1mL，置于25℃水浴中預(yù)熱20min。加入2.5mmol/L的鄰苯三酚0.4mL，混勻后置于25℃水浴中反應(yīng)4min，立即用2滴8mol/L的HCl中止反應(yīng)。用去離子水調(diào)零，325nm處測定吸光度值?？瞻捉M以0.1mL去離子水代替樣品。每個樣品平行測定3次，取平均值，按下式計(jì)算樣品液的抑制率。

式中:E-樣品對O2-·的抑制率，%；S空白-鄰苯三酚的自氧化速率；S樣品-加入樣品后的氧化速率。

1.2.2 豬血多肽亞鐵螯合鹽對過氧化氫的清除實(shí)驗(yàn)[10-11]

過氧化氫清除率采用碘量法進(jìn)行測定：在模擬胃液條件下測定樣品的過氧化氫清除率。pH3.0，0.1mol/L檸檬酸緩沖液5.0mL，樣品溶液適量，定容至25mL，加入濃度約0.015mol/L過氧化氫（用時配制）1.0mL，置37℃恒溫水浴中保持20min，取出，加入10%KI溶液2mL，2mol/L H3PO41mL， 暗 處 反 應(yīng) 120min，用0.002mol/L Na2S2O3溶液滴定。以1%～2%淀粉溶液指示終點(diǎn)，同時以雙蒸水為空白。H2O2消除量測定采用碘量法，其原理如下：

式中：V0-空白所消耗Na2S2O3的體積，mL；V1-添加樣品后消耗Na2S2O3的體積，mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬血多肽亞鐵螯合鹽對超氧陰離子自由基（O2-·）的清除作用

在生物體內(nèi)的氧化還原反應(yīng)體系中，大致有2%～5%的氧會產(chǎn)生O2-·，O2-·是活性氧的一種，是基態(tài)氧接受一個電子后形成的第一個氧自由基，可以經(jīng)過一系列反應(yīng)生成其他的氧自由基[12]。O2-·也是機(jī)體內(nèi)壽命最長的自由基，通常作為自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的引發(fā)劑，產(chǎn)生活性更強(qiáng)的羥自由基·OH，進(jìn)一步給機(jī)體造成更大的危害[13-14]。本實(shí)驗(yàn)通過鄰苯三酚自氧化產(chǎn)生O2-·，研究了豬血多肽亞鐵螯合鹽在體外對O2-·的抑制作用，結(jié)果見圖1和圖2。

圖1 鄰苯三酚自氧化過程吸光度的變化

圖2 鄰苯三酚自氧化過程吸光度的變化

圖1表明，隨著反應(yīng)時間的延長，溶液吸光度先增加后降低。當(dāng)反應(yīng)時間在0～50min之間時，隨著時間的延長，溶液吸光度增加，表明氧化產(chǎn)物增加；未添加清除劑組的吸光度顯著高于添加了豬血多肽亞鐵螯合鹽組，這說明豬血多肽亞鐵螯合鹽可以清除超氧陰離子自由基（O2-·），抑制鄰苯三酚自氧化過程產(chǎn)生的中間產(chǎn)物，因此具有較強(qiáng)的清除O2-·的能力。從圖2還可看出，當(dāng)反應(yīng)時間在2～6min之間時，不論是否添加了清除劑，鄰苯三酚自氧化過程中溶液吸光度與反應(yīng)時間均成直線關(guān)系，利用最小二乘法原理[15]得到方程y=0.0593x+0.1549，R2=0.997（未添加清除劑）；y=-0.0054x+0.1766，R2=0.9711（含0.979mg/mL豬血多肽亞鐵）。對回歸方差進(jìn)行方差分析（F檢驗(yàn)法），結(jié)果見表1和表2。

表1 回歸方程方差分析表（未添加清除劑）

表2 回歸方程方差分析表（含0.979mg/mL豬血多肽鐵）

由回歸方程方差分析表1和表2可知，未添加清除劑時F＞F0.01，回歸方程極顯著，這說明吸光度與時間的線性關(guān)系極顯著；當(dāng)添加了豬血多肽亞鐵時，F(xiàn)0.01＞F＞F0.05，回歸方程顯著，這說明吸光度與時間的線性關(guān)系顯著。因此，在2～6min這段時間內(nèi)可以認(rèn)為鄰苯三酚自氧化速率一定，超氧陰離子釋放速率一定。從圖2還可以看出，添加0.979mg/mL豬血多肽亞鐵組的氧化曲線一直在未添加清除劑的氧化曲線以下，這說明豬血多肽亞鐵抑制了鄰苯三酚的自氧化，減少了超氧陰離子的產(chǎn)生。

2.2 幾種物質(zhì)對超氧陰離子清除作用的比較實(shí)驗(yàn)

分別配制不同濃度的樣品液（豬血多肽、豬血多肽亞鐵和Vc），取1mL，按上述方法測定不同濃度的樣品對超氧陰離子自由基（O2-·）的抑制率，結(jié)果見圖3和圖4。

圖3 幾種物質(zhì)對超氧陰離子自由基的清除作用

從圖3可看出，豬血多肽、豬血多肽亞鐵螯合鹽和維生素C對堿性鄰苯三酚體系產(chǎn)生的超氧陰離子（O2-·）均具有一定的清除作用，并且隨著濃度的上升，溶液吸光度下降，清除作用增強(qiáng)。由圖4可知，豬血多肽、豬血多肽亞鐵螯合鹽和維生素C對堿性鄰苯三酚體系產(chǎn)生的超氧陰離子自由基（O2-·）均具有抑制作用，并且抑制率隨著濃度的上升而上升。

圖4 幾種物質(zhì)對超氧陰離子自由基的抑制率

從圖3和圖4還可看出，三種物質(zhì)對超氧陰離子（O2-·）清除能力的強(qiáng)弱順序?yàn)榫S生素C＞豬血多肽亞鐵＞豬血多肽，在低濃度下維生素C對超氧陰離子自由基（O2-·）的清除作用最強(qiáng)，豬血多肽亞鐵螯合鹽稍弱于維生素C，但是隨著濃度的增大，豬血多肽亞鐵螯合鹽對超氧陰離子自由基（O2-·）的清除能力越接近于維生素C，這說明豬血多肽亞鐵螯合鹽是一種較好的抗氧化劑。

2.3 豬血多肽亞鐵螯合鹽對過氧化氫的清除實(shí)驗(yàn)

所有能夠產(chǎn)生超氧陰離子自由基的生物體系都能通過歧化反應(yīng)產(chǎn)生過氧化氫，過氧化氫是一種強(qiáng)氧化劑，具有良好的擴(kuò)散性，容易透過細(xì)胞膜，并引起氧化損傷[16-17]。在有過渡金屬離子存在時，便會發(fā)生典型的Feton反應(yīng)，生成羥自由基（·OH）[18-19]。羥自由基（·OH）是已知最活潑的活性氧自由基，也是危害最大的氧自由基。過量H2O2的毒害作用類似于氧自由基，可導(dǎo)致人體遺傳物質(zhì)DNA損傷及基因突變，可能具有致癌的危險性，也可能加速人體的衰老進(jìn)程。因此，在相關(guān)研究中也將其作為氧自由基對待[20]。如果體系中某種物質(zhì)對過氧化氫清除率越高，則表明對活性氧清除作用越強(qiáng)。自由基產(chǎn)生過多或清除過慢，它通過攻擊生命大分子物質(zhì)及各種細(xì)胞器，會造成機(jī)體在分子水平、細(xì)胞水平及組織器官水平的各種損傷，加速機(jī)體的衰老過程并誘發(fā)各種疾病[21]。由此可見，清除體內(nèi)的過量過氧化氫有著非常重要的意義。本實(shí)驗(yàn)研究了豬血多肽、豬血多肽亞鐵和維生素C對過氧化氫的清除作用，結(jié)果見圖5。

圖5 幾種物質(zhì)對過氧化氫的清除作用

圖5表明，在模擬胃液的條件下，豬血多肽、豬血多肽亞鐵和維生素C均具有一定清除過氧化氫的能力，其強(qiáng)弱順序?yàn)榫S生素C＞豬血多肽亞鐵＞豬血多肽，并且三種物質(zhì)的清除率隨著濃度的升高而增加，如當(dāng)豬血多肽亞鐵的濃度為0.3914mg/mL時對過氧化氫的清除率為50.61%，在最高質(zhì)量體積濃度（0.5872mg/mL）下，豬血多肽亞鐵對過氧化氫的清除率為69.51%，這表明豬血多肽亞鐵螯合鹽具有較強(qiáng)的清除過氧化氫的能力。

3 結(jié)論

3.1 豬血多肽亞鐵螯合鹽能清除超氧陰離子自由基（O2·-），抑制鄰苯三酚自氧化過程產(chǎn)生的中間產(chǎn)物，具有較強(qiáng)的清除超氧陰離子自由基（O2·-）的能力。

3.2 維生素C、豬血多肽亞鐵和豬血多肽這三種物質(zhì)對超氧陰離子自由基（O2-·）清除能力的強(qiáng)弱順序?yàn)榫S生素C＞豬血多肽亞鐵＞豬血多肽，豬血多肽亞鐵螯合鹽是一種較好的抗氧化劑。

3.3 豬血多肽亞鐵螯合鹽能清除過氧化氫（H2O2），維生素C、豬血多肽亞鐵和豬血多肽這三種物質(zhì)對過氧化氫清除能力的強(qiáng)弱順序?yàn)榫S生素C＞豬血多肽亞鐵＞豬血多肽，說明豬血多肽亞鐵螯合鹽具有較強(qiáng)的清除過氧化氫的能力。

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Study on antioxidant activity of chelated pig blood polypeptide ferrite in vitro

WANG Xue-rong1,PENG Xiang-wei2,KAN Jian-quan3,*

（1.Animal Science Department of Southwest University Rongchang Campas,Chongqing 402460,China；2.Chongqing Academy of Animal Science,Chongqing 402460,China；3.Food Science Institute of Southwest University,Chongqing 400715,China）

The elimination of chelated pig blood polypeptide ferrite on superoxide radical anion （O2-·） and hydrogen peroxide （H2O2） was studied and the clearance abilities of vitamine C，pig blood polypeptide ferrite and pig blood polypeptide were compared.The results showed that the chelated pig blood polypeptide ferrite could remove superoxide radical anion （O2-·） and hydrogen peroxide （H2O2）.The remove ability of the chelated pig blood polypeptide ferrite was weaker than that of vitamin C，but stronger than that of pig blood polypeptides，so the chelated pig blood polypeptide ferrite had relatively strong ability of removing superoxide radical anion （O2-·）and hydrogen peroxide （H2O2）.

pig blood polypeptide ferrite；antioxidant activity；superoxide radical anion；hydrogen peroxide

TS251.1

A

1002-0306（2011）10-0135-04

2010-12-07 *通訊聯(lián)系人

汪學(xué)榮（1972-），男，博士，副教授，研究方向：畜禽副產(chǎn)品綜合利用與開發(fā)。

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金；西南大學(xué)博士基金項(xiàng)目（09BSr07）。